כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

DBS שימשו במשך 100 שנים² , אבל, למרבה ההפתעה, יש עדיין אין הסכמה כללית לגבי הכנה ועיבוד שלהם. עד כה, האחדה מספיקות של שלב טרום אנליטי חשוב זה רק הושגה בתחום של היילוד ההקרנה¹⁴, ואילו במגוון של פרוטוקולים שונים קיימת עבור כל היישומים האחרים של DBS בדיקה^{5, 16, 23}. כדי להתגבר על הטרוגניות המדהימה הזו, הוא הוראה צעד אחר צעד מקיפים להכנה של עיבוד DBS כדי להיות מנוצל immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות שהוצגו בתקשורת זו, ביחס יעילותו זיהוי סמנים של HBV, בזכות דלקות HIV. מוקד הדיון הבא מושם בעיקר על השלבים השונים של הפרוטוקול המוצע.

בהיסטוריה של DBS בדיקות רבות נייר סינון שונות כרטיסי היו בשימוש² אבל רק היום שני מקורות מסחריים אושרו על ידי ה-FDA כמו class II ומכשור רפואי עבור הדם אוסף^{5, 16}. מערכות אלו כרטיס מסנן מאוד אחידה, יש מאפיינים דומים מאוד הקליטה כך התוצאות האנליטיות המתקבל נימי דם שהוכנו על אף אחד מהם לא שונות על ידי יותר מ- 4% – 5%²⁸. באופן לא מפתיע, Masciotra ועמיתים²⁹ ולכן זוהה RNA HIV-1 מידה עם assay איכותי לאחר • תנאי מן הדם אוסף קלפים ממקורות שונים. לאור נתונים אלה, זה יכול להיות כמעט לא נכלל כי כל אחד הסתירות הקיימות בעת בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות של סמני של HBV, בזכות, HIV זיהומים¹⁷ נגרם על ידי הבחירה של הכרטיס מסנן לבד. עם זאת, כאשר כימות מדויק של analyte הכרחי, וריאציית המקור-כדי-מקור עשויים להיות לא זניח וניקב טכניקות מתוחכמות יותר, למשל, DBS (PDBS) כשיטה microsampling³⁰ או הכנה המקומות סרום מיובשים (DSS)³¹ ייתכן שתחול במקום DBS הקונבנציונלית בדיקות¹⁰.

מאז רק כמויות קטנות של דם משמשים DBS בדיקות (טיפה אחת של דם קפילרי מורכב µl כ-50)^{5, 16}, וריאציות באמצעי האחסון מדגם מכריעים ובבית, אמנם, לפחות לחלק בין תוצאות סרולוגית של המשתתף דיווח עצמי HBV ומצב בזכות שנרשם במהלך הטיס “המחקר דרוק” הם לייחס משתנה זה. הגורם החשוב ביותר יחיד עבור מזעור “תנודות” של אמצעי האחסון מדגם הוא ללא ספק טכניקה נכונה של אוסף נימי דם, אשר יכולה להיות מושגת רק על ידי הכשרה זהיר ומתמשכת של הסגל הטכני²². יתרה מזאת, כאמצעי של בקרת איכות, כל המעבדות עובד עם DBS צריך כבר יזמו הנהלים לזיהוי, לאחר מכן למעט דגימות DBS צריך להיחשב חוקיים משביע רצון או¹⁶.

מחקרים שנערכו בעיקר בהקשר של HIV³² ו ההקרנה היילוד³³ הראו כי לחות גבוהה עלולה להוביל הפירוק של analytes, אבל עד כה אין הסכמה הושגה לגבי שאלת כמה זמן DBS צריך להיות אוויר יבש . מרווח זמן לפחות 4 שעה או רצוי O/N מוצע זה תקשורת, שאימצו לכן את התנאים שבהם נהגו ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית^{32, 34} נתונים על אחסון של DBS, לאחר מכן ניתן להשתמש עבור HBV ו בזכות בדיקות מתנגשים. בשנת 1981, וילה ועמיתים³⁵, מי שנרשם עכשוויים בשיטות אנליטיות, דיווחו כי אחסון ב- RT לא השפיע על התוצאות של HBV ניתוחים במהלך כל תצפית של 180 ימים אם היו נוגדנים titers > 1/1000, אבל זה DBS הפכה גבולי-חיובית או שלילית אפילו לאחר 15 ימים כאשר titers בנסיוב היו רק 1/100. אחסון-20 ° C או 4 ° C לא לגרום לשיפור משמעותי. לעומת זאת, במחקר שנערך שלושים שנה מאוחר יותר³⁶ נבדק ושכפול של מדגם HBV חיובי, ומצא המחברים את anti-HBc כמו גם נוגדנים anti-HBs היו יציבים עד 183 ימים ב- RT, ואילו HBsAg מתחת לאותם התנאים הפך false-שלילי כבר אחרי 63 ימים. לגבי זיהוי HBV DNA מ- DBS eluates, ריכוז חומצות גרעין נגיפיות הייתה יציבה לפחות שבעה ימים ב- 37 ° C³⁷ או הוכיח להיות “עמיד” אחסון ב- RT עד שלושה שבועות³⁸. בדיקת נוגדנים בזכות באמצעות שני דור שלישי זמינים מסחרית immunoassays³⁹ סיפק תוצאות מדויקות עבור תקופה של 117 ימים באמצעות דגימות DBS המאוחסנים ב-20 ° C, 2-8 ° C ו- 20 – 25 ° C, בהתאמה. אחסון ב-20 ° C, עם זאת, הביא הווריאציה הנמוך של צפיפות אופטית. החלת אנטי-בזכות של הדור הרביעי, אליסה, קרי, Monolisa בזכות-Ag-Ab-ULTRA, בהקשר של DBS בדיקות, Larrat. et al. ⁴⁰ נצפתה ירידה חדה בירידה לפרטים אנליטי לאחר אחסון דגימות DBS במשך יותר משלושה ימים-RT. מצד שני, התקבלו תוצאות בדיקה מדויקת עם ערכת אותו ניצול דגימות שהופקדו למשך 60 ימים בתנאים שונים (-20 ° C, 2-8 ° C ו- 22 – 26 ° C) על ידי Brandao ועמיתים⁴¹. תצפיות על הירידה של RNA בזכות ריכוזים ב DBS בתנאים אחסון שונים בטווח של אין שינוי משמעותי ב RT עבור שנה אחת עד⁴² עד שינוי tenfold לאחר ארבעה שבועות-טמפרטורת הסביבה⁴³. לוקחים את הנתונים הסותרים מעדיף על היציבות של HBV ו אנטיגנים בזכות, חומצות גרעין, נוגדנים בחשבון, נראה סביר לסגת בפרוטוקול המוצע להחלטה, אשר הוגדרה קודם לכן עבור האחסון של דגימות DBS שישמש עבור HIV בדיקות^{15, 30}: עבור התצהיר לטווח קצר (עד שבועיים) אנטיגנים, חומצת גרעין נגיפיות, נוגדנים הם נחשבים יציבה-RT, ואילו האופטימלי אחסון לתקופות ארוכות על התנאים קפוא.

ככלל, שלושה פרמטרים שיש לשקול בעת תכנון פרוטוקול • תנאי: (1) המאגר • תנאי; (2) משך זמן וטמפרטורה של • תנאי; (3) • תנאי האחסון²³. ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) שימש eluting DBS, והוסיף הסופרים חלבון, למשל, אלבומין שור (BSA) או Tween 20, חומרים פעילי, שטח-על מנת לשפר את האות assay על-ידי ייצוב חלבונים, כמו שהם הולכים לתוך פתרון, מחייב שאינם ספציפיים בו זמנית חסימת אתרים²³. רק כמה דוחות, אשר ישירות להשוות מאגרים שונים • תנאי בהקשר של בדיקות DBS, הינם זמינים. Villar. et al. ³⁶, למשל, נרשם כמעט שוות ערך • תנאי קיבולות למאגרי כל שימוש, אלא PBS/BSA 0.5%, גרמו ברמה הנמוכה ביותר של תגובתיות שאינם ספציפיים. אבחנה דומה מאוד נעשתה על ידי כרום ועמיתים⁴⁴ בשעת החלת את diluent הדגימה של rLAV גנטיקה מערכות EIA עבור • תנאי של נוגדנים בזכות מ- DBS. מאז הסיכון של מדגם השפלה היא מאוד נמוכה בשעות הראשונות לאחר הכנת DBS (ראה לעיל), הוחלט דגירה המקומות O/N בטמפרטורת החדר, כדי לתמוך בתהליך • תנאי על ידי ערבוב מעל קצה-עדין. גישה זו יש יתרון כי דגימות אגרוף הקודם יום ישירות יועברו שגרתית אבחון מוקדם הבא בבוקר²³. צריך להיות מותאם היקף המאגר • תנאי הדרישות המתאימות מינימלי של מבחני המשמש ניתוחים הבאים על מנת לשמור את הגורם לדילול נמוך ככל האפשר. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד איננה אפשרית בהערכה הקודמת כי תפוקה גבוהה לדוגמה היה צריך להיות מובטחות תוך זמן קצר יחסית במהלך ה “דרוק לימוד”¹⁷. כתוצאה מכך, נפח שלילי למדי של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS שימש כדי להשלים את התהליך כולו • תנאי עבור כל הפרמטרים של שתי פעולות נפרדות.

גישה זו אחד מצד אחד נכשל “לחלוטין במערכת anti-HBc/anti-HBs עבור אותם אנשים נגועים בנגיף ה-HIV עקב ריכוז נוגדן נמוכה; . זה נדרש הליכים ביולוגית מולקולרית עם רגישות אנליטי אופטימלי ביחס HBV DNA ו RNA בזכות בדיקות. ” ¹⁷ מצד שני, אמצעי האחסון גבוה • תנאי הוכיחה להיות בשום אופן חסרון מצפני HBsAg בזכות, נגד HIV על ידי ערכות בשימוש בכל רחבי ההערכה. “זיהוי HBsAg חומרים חיוביים של דם מלא eluates הצליח עם רגישות של 98.6% במידה גבוהה באופן דומה כמו מחקרים קודמים, אשר השתמשה באופן חלקי נפח • תנאי קטן בהרבה של 100 µl, 250 µl, או 600 µl או 500 µl”^{17 ,36, 45, 46}. הרגישות של 97.8% נקבע בחקירת זוגות סרום/DBS 179 עבור בזכות נוגדנים תאמו התוצאות שכבר קיימים דוחות^{24, 44, 47, 48, 49}, אשר עבד עם אמצעי אחסון • תנאי זה היה נמוך פי 5 עד 10. “בנוסף, הפרוטוקולים לגילוי בזכות היה כבר כראוי ממוטב. מאת הקובעת נקודות ניתוק משלהם”^{17, 24, 48, 49} “או על-ידי הגברת אמצעי האחסון מדגם של 20 µl כדי 100 µl” ^{בן 17, 49} . סוף סוף, ירידה לפרטים אנליטי רגישות (100% כל אחת) הוקמה לגילוי HIV אנטי היו שווה או גבוהה ממנו מאפייני ביצועים של אחרים immunoassays המותאמים במיוחד DBS בדיקות^{50, 51} “או של stepwise נוהל עם השימוש בשילוב של מספר בדיקות האיידס”^17,52. “הם, אכן, גם חריגה תיעוד ביצועים assay זה היה מיוחד פותחה, ממוטב עבור זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates (Q-למנוע HIV 1 + 2 מקיט DBS).” ^{17, 53}  

יחדיו, את הפרוטוקול צעד אחר צעד מקיף שהוצגו בתקשורת זו התבררה כלי ידידותי למשתמש ריאלי הכנה ועיבוד DBS ואת, לכן, ניתן להשתמש בצורה אמינה וירולוגיה אבחון. זה מאפשר גישות באמצעות אוטומציה ⁵⁴ , בשל מאפייניו ביצועים מצוינים יש פוטנציאל לשמש סוג של אבן-היסוד עבור פרוטוקול בעתיד הסכמה כללית מקובלת בתחום הגלובלי DBS בדיקות מעבדה הרפואה.