Taches de sang séché - préparer et traiter pour utilisation dans les immunoessais et Techniques moléculaires

DBS ont été utilisés pour 100 ans² mais, étonnamment, il n’y a encore aucun consensus sur leur préparation et le traitement. A ce jour, une normalisation suffisante de cette importante phase pré-analytique a seulement obtenue dans le domaine du dépistage néonatal¹⁴, une variété de différents protocoles existe pour toutes les autres applications de DBS test^{5, 16, 23}. Pour surmonter cette hétérogénéité remarquable, un enseignement complet étape par étape pour préparer et traiter les DBS devant être utilisée dans les immunoessais et par des techniques moléculaires est présentée dans la présente communication et évaluée en ce qui concerne son efficacité pour la détection des marqueurs des infections à VHB, VHC et VIH. La mise au point de la discussion qui suit est principalement mis sur les différentes étapes du protocole suggéré.

Dans l’histoire de DBS essais nombreux papier-filtre différentes cartes ont été utilisées² mais aujourd’hui seulement deux sources commerciales sont approuvés par la FDA comme dispositifs médicaux de classe II pour blood collection^{5, 16}. Ces systèmes de carte de filtre sont très uniformes et ont des caractéristiques d’absorption très similaires afin que les résultats d’analyse obtenus à partir de sang capillaire préparé sur un d’eux ne diffèrent pas de plus de 4 % à 5 %,²⁸. Il n’est pas surprenant, Masciotra et ses collègues²⁹ détecté donc ARN du VIH-1 aussi bien avec un essai qualitatif après élution de cartes de collection de sang provenant de différentes sources. Compte tenu de ces données, il peut être pratiquement exclu que tout les écarts observés lors du test couplé paires de sérum/DBS pour marqueurs du VHB, VHC et VIH infection¹⁷ a été causée par le choix de la carte filtre seul. Toutefois, lorsqu’une quantification précise d’un analyte est indispensable, variation de la source à l’autre peut-être ne plus être négligeable et des techniques plus sophistiquées, par exemple, perforé DBS (PDB) comme méthode de Microprélèvement³⁰ ou la préparation des taches de sérum séché (DSS)³¹ peut devraient s’appliquer au lieu de DBS classiques tests¹⁰.

Étant donné que de petites quantités de sang sont utilisées pour les essais de DBS (une goutte de sang capillaire se compose d’environ 50 µl)^{5, 16}, variations dans le volume de l’échantillon sont essentiels et, certes, au moins une partie de l’écart entre les résultats sérologiques et du participant autodéclaré statut VHB et VHC enregistré pendant le pilotage de l’étude « DRUCK » sont imputables à cette variable. Le facteur le plus important pour réduire les « fluctuations » volume de l’échantillon est sans aucun doute une bonne technique de prélèvement sanguin capillaire, qui ne peut être atteint par une formation attentive et continue du personnel technique²². En outre, en tant que mesure de contrôle de la qualité, tous les laboratoires qui travaillent avec SRD devraient ont déjà lancé des procédures d’identification et par la suite, à l’exclusion des spécimens DBS qui doivent être considérées comme insatisfaisantes ou invalide¹⁶.

Des études menées principalement dans le contexte du VIH³² et dépistage néonatal³³ ont montré que le taux d’humidité élevé peut conduire à une dégradation des analytes, mais jusqu’ici aucun consensus ne s’est dégagé au sujet de la question de combien de temps les DBS doit être séché à l’air . Un intervalle d’au moins 4 heures ou de préférence O/N est proposé dans la présente communication, qui a donc adopté des conditions qui ont servi dans la grande majorité de toutes les publications pertinentes^{32, 34} données sur le stockage de DBS à servir par la suite pour le VHB et le VHC test sont contradictoires. En 1981, Villa et ses collègues³⁵, qui ont appliqué les techniques d’analyse contemporaines, a signalé que stockage à RT n’a pas affecté les résultats des analyses de VHB pendant la période d’observation complète de 180 jours si les titres d’anticorps étaient > 1/1 000, mais cette DBS est devenu borderline-positif ou négatif même après 15 jours, quand les titres dans le sérum sont seulement de 1/100. Stockage à-20 ° C ou 4 ° C n’a pas entraîné une amélioration substantielle. En revanche, une étude réalisée trente ans plus tard³⁶ testé réplique d’un échantillon de VHB positifs, et les auteurs ont constaté qu’anti-HBc ainsi que les anticorps anti-HBs étaient stables jusqu’à 183 jours à ta, tandis qu’AgHBs dans les mêmes conditions est devenu faux-négatifs déjà après 63 jours. En ce qui concerne la détection de l’ADN du VHB d’éluats DBS, la concentration de l’acide nucléique viral a été stable pendant au moins sept jours à 37 ° C³⁷ ou s’est avéré « résistants » au stockage à ta jusqu’à trois semaines³⁸. Dépistage des anticorps anti-VHC à l’aide de deux disponible dans le commerce de troisième génération immunoessais³⁹ a fourni des résultats précis pendant 117 jours en utilisant des échantillons DBS conservés à-20 ° C, 2 et 8 ° C et 20 – 25 ° C, respectivement. Stockage à-20 ° C, cependant, a entraîné la plus faible variation des densités optiques. Appliquer un anti-VHC de quatrième génération ELISA, c.-à-d. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, dans le contexte de DBS, essais, Larrat et al. ⁴⁰ a observé une diminution forte spécificité analytique après avoir mémorisé les spécimens DBS pendant plus de trois jours à température ambiante. En revanche, les résultats des tests précis ont été obtenus avec le même kit utilisant les échantillons déposés pendant 60 jours dans des conditions différentes (-20 ° C, 2 et 8 ° C et 22 à 26 ° C) par Brandao et collègues de travail⁴¹. Observations sur la baisse des concentrations de l’ARN du VHC dans DBS dans diverses conditions de stockage comprise entre aucune modification notable à RT pour jusqu’à un an⁴² et un changement décuplée après quatre semaines à température ambiante⁴³. Prenant ces données plutôt contradictoires sur la stabilité du VHB et VHC antigènes, acides nucléiques et des anticorps en considération, il semblait raisonnable de se rétracter dans le projet de protocole à un consensus, ce qui a été défini précédemment pour le stockage des spécimens DBS à utiliser pour Dépistage de^{15, 30}: pour les dépôts à court terme (jusqu’à deux semaines) anticorps, antigènes et l’acide nucléique viral sont considérés comme stables à RT, alors que des conditions de gel ideale pour des périodes plus longues.

Trois paramètres en règle générale, sont à considérer lors de la conception d’un protocole d’élution : (1) la mémoire tampon d’élution. (2) la durée et la température d’élution ; et (3) l’élution tome²³. Dans la grande majorité de toutes les publications pertinentes solution saline tamponnée au phosphate (PBS) servait à élution de DBS, et la plupart des auteurs a ajouté une protéine, par exemple, l’albumine sérique bovine (BSA) ou Tween 20, un agent tensio-actif, afin d’améliorer le signal de test en stabilisant protéines, car ils vont dans la solution et en même temps blocage non-spécifiques sites²³. Seuls quelques rapports qui comparer directement les tampons d’élution différents dans le cadre des essais de DBS, sont disponibles. Villar et al. capacités d’élution presque équivalent à tous les tampons utilisés, mais PBS/BSA a enregistré ³⁶, par exemple, 0,5 % ont abouti à la plus faible de réactivité non spécifique. Une observation très similaire a été faite par Croom et ses collègues⁴⁴ lorsque vous appliquez le diluant de l’échantillon de la Genetics Systems rLAV EIE pour l’élution des anticorps anti-VHC de DBS. Étant donné que le risque de dégradation de l’échantillon est extrêmement faible dans les premières heures après la préparation de DBS (voir ci-dessus), il a été décidé à incuber les taches O/N à la température ambiante et à soutenir le processus d’élution en mélangeant la fin plus douce. Cette approche a l’avantage de spécimens poinçonnés de la précédente journée peut être directement transférée au diagnostic de routine au début du prochain matin²³. Il convient d’adapter le volume de la mémoire tampon d’élution minimal part aux exigences des essais utilisés pour les analyses suivantes afin de conserver le facteur de dilution aussi bas que possible. Toutefois, une optimisation minutieuse des conditions d’élution pour chaque analyte unique n’était pas possible dans l’évaluation précédente parce qu’un débit élevé échantillon devait être garanti en relativement peu de temps au cours de l’ « Étude de DRUCK »¹⁷. Par conséquent, le volume plutôt défavorable de 1 000 µl de tampon PBS a été utilisé afin de compléter le processus entier d’élution pour tous les paramètres dans deux opérations distinctes.

Cette approche une part échoue « complètement dans le système anti-HBc/anti-HBs pour les personnes infectées par le VIH en raison de la concentration d’anticorps faible ; … et il nécessaire procédures biologiques moléculaires avec une sensibilité analytique optimale en ce qui concerne l’ADN du VHB et l’ARN du VHC teste. » ¹⁷ en revanche, le volume d’élution élevé avéré pour être en aucune manière désavantageuse pour le dosage de l’antigène HBs, anticorps anti-VHC et anti-VIH par les kits utilisés tout au long de l’évaluation. « La détection de l’AgHBs positifs issus de sang total éluats a réussi avec une sensibilité de 98,6 %, à un degré élevé de même que dans les études précédentes, qui avait utilisé en partie d’un plus petit volume d’élution de 100 µl, 250 µl, 600 µl ou 500 µl »^{17 ,36, 45, 46}. La sensibilité de 97,8 % constatés lors de l’enquête de 179 paires de sérum/DBS pour anticorps anti-VHC correspondaient aux résultats d’un existant rapporte^{24, 44, 47, 48, 49}, qui avait travaillé avec un volume d’élution qui était inférieur d’un facteur de 5 à 10. « En outre, les protocoles pour la détection des anticorps anti-VHC avaient été convenablement optimisés… en précisant leurs propres points de coupure »,^{17, 24, 48, 49} « ou en augmentant les volumes d’échantillon de 20 µl à 100 µl. » ^{17, 49} Enfin, la spécificité analytique et la sensibilité (100 %) mis en place pour la détection des anti-VIH étaient égaux ou supérieurs à d’autres immuno-essais spécifiquement adaptés aux DBS essai^{50, 51} , les caractéristiques de performances « ou un pas à pas procédure avec l’utilisation combinée de plusieurs tests anti-VIH »^17,52. « Ils ont, en effet, d’aussi dépassaient le record de performance d’un test qui a été spécialement développé et optimisé pour la détection des anticorps anti-VIH dans les éluats DBS (Q-Prevent HIV 1 + 2 kit de DBS). » ^{17, 53}  

Pris ensemble, le protocole étape par étape complète présenté dans la présente communication s’est avéré pour être un outil faisable et facile à utiliser pour la préparation et le traitement DBS et peut, ainsi, être utilisé avec fiabilité en virologie diagnostique. Il permet des approches utilisant automation ⁵⁴ et en raison de ses caractéristiques excellentes performances a le potentiel pour servir en guise de première pierre pour un protocole futur consensus généralement reconnus dans le champ global de DBS, essais en laboratoire médecine.