La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em> Drosophila melanogaster</em

1. Recoger y preparar moscas Posterior D. melanogaster bajo las condiciones experimentales deseados. Tenga cuidado de no saturar las moscas durante la crianza y asegúrese de que las densidades de larvas son consistentes a través de los tratamientos, ya que las condiciones ambientales durante la etapa larval pueden afectar profundamente fenotipos de defensa inmune durante la etapa adulta. 15 Recoger moscas experimentales 0-3 días después de la eclosión de la caja de pupa y transferirlos a un medio fresco. Casa de las moscas recolectadas a una temperatura deseada (temperaturas entre 22 ° C y 28 ° C son generalmente adecuados) hasta que tengan 5 – 7 días después de la eclosión. NOTA: Esto da tiempo suficiente para que las moscas para completar la metamorfosis y convertirse en adultos maduros, pero es así antes de que comience la senescencia. Ordena el número deseado de moscas en un vial separado antes de la infección, de nuevo teniendo cuidado de evitar el hacinamiento. NOTA: Sólo males están infectados en esta demostración, pero es igualmente posible infectar hembras utilizando el procedimiento descrito. 2. Preparar cultura y bacterias Preparar un plato principal de las bacterias elegidas al menos 2 días antes de la infección. Racha de las bacterias de un glicerol 15% almacenados indefinidamente a -80 ° C. Guarde la placa maestra a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. Siempre racha de las placas maestras directamente desde el glicerol congelado. Evite el paso en serie de las bacterias de la placa a la placa, como paso repetido en la cultura puede hacer que las bacterias evolucionan virulencia atenuada. NOTA: En este ejemplo se hace uso de Providencia rettgeri y Escherichia coli. Utilice el siguiente procedimiento para preparar una suspensión bacteriana para inyección. Crecer una cultura 2 ml de bacterias mediante la inoculación de medio estéril con una sola colonia aislada de la placa maestra. Crecer las bacterias a la fase estacionaria (por ejemplo, </em> O / N de crecimiento a 37 ° C). NOTA: Tanto P. rettgeri y E. coli crecen bien en Luria Broth a temperaturas desde 20 hasta 37 ° C con agitación suave. Una vez que la cultura ha llegado a la fase estacionaria, sedimentar suavemente las células a partir de aprox. 600 l de la cultura en una centrífuga de mesa (3 min a 5.000 xg), descartar el sobrenadante y resuspender las bacterias en aprox. 1000 l de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na 2 PO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH = 7,4). Diluir las células se resuspendieron en PBS estéril para alcanzar una densidad óptica (OD) apropiado para la bacteria que se utiliza, medido con un espectrofotómetro como la absorbancia a 600 nm. Utilice esta suspensión para infectar las moscas. NOTA: A 600 = 0,1 o 1,0 corresponde, respectivamente, a aproximadamente 10 8 y 10 9 Providencia rettgeri o E. coli por ml. Debido a que ambos viven unand bacterias muertas contribuyen a la densidad óptica, es importante para cosechar cultivos en fase estacionaria temprana antes de cadáveres bacterianas se acumulan y distorsionar la relación entre densidad óptica y el número de bacterias viables introducidas durante la infección. 3. Infectar las Moscas NOTA: Como Drosophila inmunidad se ve influenciado por el ritmo circadiano, es importante llevar a cabo las infecciones a la misma hora del día a través de repeticiones experimentales 16. 3.1) El uso de un Nanoinjector Preparar las agujas de vidrio para la infección. Preparar una aguja de vidrio tirando de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor micropipeta. El uso de pinzas, rompa la punta de la aguja para crear una abertura de aproximadamente 50 m de diámetro para permitir la eyección de líquido. Montar el inyector. Coloque el sellado de la junta tórica y luego el sp blancoacer (grande hoyuelo hacia afuera) sobre el émbolo de metal. Llene la aguja de vidrio con aceite mineral usando una jeringa con una aguja 30 G. Ponga la aguja de vidrio lleno a través de la pinza y coloque la junta tórica grande alrededor de su base, alrededor de 1 mm desde el extremo romo de la aguja. Deslice la aguja sobre el émbolo de metal y el tornillo suavemente en la pinza hasta que quede firme. Expulsar la mayor parte del aceite mineral desde el inyector, pero asegúrese de que todavía hay un pequeño volumen de aceite en la aguja para actuar como una barrera entre el inyector y la suspensión bacteriana. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el aceite mineral o suspensión bacteriana, o entre los dos líquidos. Ajuste el inyector hasta el volumen deseado para inyección (entre 9 y 50 nl nl). Generar hiriendo controles. Llene la aguja del inyector con PBS estéril cuidadosamente mediante la inserción de la punta de la aguja capilar en un tubo de los medios de comunicación y pressing en el botón "llenar" en el inyector. NOTA: Estéril medios de crecimiento bacteriano también se puede utilizar un control hiriendo si el experimento requiere la inyección de bacterias suspendidas en su medio de crecimiento. Sin embargo, debido a los medios de crecimiento bacteriano contiene componentes que pueden estimular el sistema inmune o tener otros efectos en el huésped, un vehículo inerte tal como PBS es preferible. Anestesiar el número deseado de moscas bajo un ligero flujo de CO 2. Inyectar las moscas en el abdomen anterior en la superficie ventrolateral con el PBS estéril. NOTA: También es posible inyectar moscas en otros sitios, como la placa de sternopleural del tórax, pero es importante para mantener el sitio de inyección consistente dentro de cada experimento 17. Coloque las moscas inyectadas en viales frescos con nuevo medio, por la que se los viales de su lado hasta que todas las moscas se han recuperado de la anestesia para evitar que las moscas se convierta pegado a la comida. <br /> NOTA: Se recomienda para inyectar las moscas de control PBS antes de la inyección de bacterias a las moscas experimentales por lo que la misma aguja se puede utilizar para ambos tratamientos. No siempre será posible usar la misma aguja para todo un experimento. En ese caso, puede ser deseable para registrar que la aguja se utilizó con el que las moscas y que incluya la identidad de la aguja como un factor experimental en el análisis estadístico. Inyectar el patógeno bacteriano. Expulsar los medios estéril restante del inyector y vuelva a llenar la misma aguja con la suspensión bacteriana. Repita el procedimiento anterior (3.1.3), ahora la inyección de las moscas con la suspensión bacteriana preparada en el procedimiento 2.2. 3.2) Con séptico Pinprick Preparar la aguja para pinchar. Derretir el final de una punta de la micropipeta 200 l e inserte un 0,15 mm pin minutien insectos en el plástico fundido. Deje que el plástico se solidifique Doch que el pasador se mantiene en su lugar con aproximadamente 0,5 cm de pasador que se extienden desde el plástico. Generar hiriendo controles. Anestesiar el número deseado de moscas bajo un ligero flujo de CO 2. Pinchar las moscas en la placa sternopleural del tórax con la aguja, evitando los sitios de unión de las alas y las patas. Si es necesario, retire con cuidado las moscas de la clavija minutien utilizando pinzas suaves. NOTA:. También es posible para pinchar las moscas en otros sitios, como el abdomen anterior en la superficie ventrolateral, pero es importante para mantener el sitio de inyección consistente dentro de cada experimento 17 Pinchazo través de la cutícula del abdomen tiende a ser más difícil que pinchar del tórax y por lo tanto menos común es. Coloque las moscas se pincha en un vial fresco con nuevo medio mosca, por el que el vial en su lado hasta que todas las moscas se han recuperado de la anestesia para evitar que las moscas de bevenida pegado a la comida. Introducir la infección bacteriana. Anestesiar el número deseado de moscas bajo un ligero flujo de CO 2. Pinchar cada vuelan en la misma ubicación que los controles de medios, sumergiendo la punta del alfiler en la suspensión bacteriana preparada en el procedimiento 2.2 antes de pincharse cada marcha. Coloque las moscas se pincha en un vial fresco con nuevo medio mosca, por el que el vial en su lado hasta que todas las moscas se han recuperado de la anestesia para evitar que las moscas se convierta pegado a la comida. 3.3) Evaluar la dosis infecciosa Delivered Infectar a un conjunto de moscas como se describe anteriormente en cualquiera de los procedimientos 3.1 o 3.2, sólo que en lugar de volver a las moscas a vial alimentos para recuperarse de la anestesia, coloque cada una mosca en un tubo de microcentrífuga en hielo. Añadir 250 l de PBS a cada tubo y homogeneizar las moscas, ya sea usando una mano de mortero o un batidor de perlas. </Li> Placa del homogeneizado en una placa de agar LB, ya sea usando un dispensador en espiral o una dilución en serie. Para la placa utilizando dilución en serie, transferir cada homogeneizado mosca a la primera fila de una placa de 96 pocillos. Llene cada pocillo de las filas restantes con 90 l de PBS. Con una pipeta multicanal, tome 10 l de la primera fila que contiene vuela homogeneizado y dispensar en la segunda fila. Pipeta de arriba abajo al menos 10 veces para mezclar bien, y luego tomar 10 l y traslado a la tercera fila. Repita este procedimiento usando las filas restantes. A partir de la fila inferior (más diluida suspensión de bacterias), utilice la pipeta multicanal para tomar 10 l de cada pocillo y se depositan sobre una placa de LB, teniendo cuidado de que las muestras se dispensan como puntos discretos que no se tocan entre sí. Repita hasta que todos los pozos han sido muestreados de cada fila, dispensación en orden descendente de la dilución en la placa LB. </li> Deja la placa a temperatura ambiente hasta que las manchas han completamente empapado en la placa LB. NOTA: El secado de la placa de LB durante unos días a temperatura ambiente antes de su uso se recomienda para asegurar que el líquido se absorbe fácilmente, reduciendo al mínimo las posibilidades de contacto accidental entre los puntos de muestra. Incubar las placas O / N, teniendo cuidado de no crecer demasiado las placas de modo colonias siguen siendo pequeños y discretos. NOTA: En función del medio de cultivo y la incubación de temperatura bacteriana utilizada, colonias derivadas de la microbiota intestinal endógena de la mosca pueden llegar a aparecer en la placa. Sin embargo, la mayoría de las bacterias utilizadas para la infección patógena crecen mucho más rápido que la microbiota intestinal en agar LB a 37 ° C. Retire las placas de la incubadora cuando las bacterias experimentales han crecido colonias visibles (típicamente 8-12 horas), pero antes de Drosophila colonias microbiota intestinal aparecen (aproximadamente 36 horas). Para las bacterias experimentales de crecimiento lento, use un selectivaantibiótico en el agar LB para eliminar cualquier colonia de la microbiota intestinal. Contar el número de colonias por cada homogeneizado. Para placas espirales, contar las colonias que crecen utilizando un contador de colonias automatizado que puede estimar la carga bacteriana por ml de homogeneizado basado en el número y posición de las colonias en la placa. NOTA: los recuentos de espirales son más precisa cuando la concentración bacteriana está en el intervalo de 5 x 10 02 al 05 x 10 4 bacterias por ml. Para placas de punto, contar manualmente las colonias para cada mosca desde cualquier dilución contiene 30 a 300 colonias y calcular el número de bacterias por ml de homogeneizado inicial. 4. Caracterizar Supervivencia de la Infección Ensayo de mortalidad después de la inyección. Coloque moscas infectadas y controles heridos en viales frescas y mantener en una incubadora a una temperatura deseada (25 ° C con un lig 12:12ht: Se recomienda oscuridad ciclo). No ponga más de 15 moscas en un solo vial como se hace difícil contar más de 15 moscas de vida. Cuente el número de moscas vivas y muertas cada día, o con mayor frecuencia si es apropiado. Con el fin de mantener la calidad de los alimentos, voltear las moscas a la nueva comida en un horario regular. Si el vial contiene sólo los machos, transferirlos a viales frescas cada tres días. Si el vial contiene hembras, transferir a viales frescos cada dos días porque la progenie larval se licuar los alimentos, lo que aumenta el riesgo de que las moscas adultas pueden atascarse y resultando en tasas sobreestimado de mortalidad debido a la infección. Analizar estadísticamente los datos. Supervivencia parcela como una curva de Kaplan-Meier, que indica la probabilidad de que un individuo sobreviva a una inyección medido puesto punto de tiempo. 18 Para las curvas de supervivencia que no crucen, realizar comparaciones por pares utilizando un Log-Rank Test (también llamada prueba de Mantel Cox) o realizar análisis más complejos utilizando un modelo de riesgos proporcionales de Cox, que puede incorporar varios factores y sus interacciones. Para las curvas de supervivencia que se cruzan, realizar un análisis de Cox estratificado. 17 5. Ensayo bacteriana Cargar post-infección Mida la carga bacteriana. En una post-inyección de tiempo prescrito, repita el procedimiento utilizado para evaluar la dosis infecciosa para determinar la carga bacteriana en el transcurso de la infección (ver protocolo 3.3). NOTA: Si utiliza el dispensador en espiral, diluir homogeneizados de manera que la suspensión bacteriana cae dentro de un rango de 1.000 – 100.000 bacterias por ml. Analizar los datos. Si la carga bacteriana es no normal, o bien transformar los datos para aproximar mejor una distribución normal o analizar los datos mediante el análisis estadístico no paramétrico (por ejemplo, la prueba de Mann-Whitney). Utilice un análisis de Box-Cox para find la transformación óptima; registro natural o de base -10 transformaciones de registro suelen ser eficaces. 19 Si los datos están suficientemente distribuyen normalmente y sólo hay dos tratamientos que se están contrastados, realizar una prueba t para determinar si los dos tratamientos dan lugar a diferentes cargas bacterianas medias. Si hay varias variables experimentales u otros posibles factores predictivos, utilice análisis de varianza (ANOVA) para determinar qué factores son predictores significativos de la carga bacteriana. 19 6. Ensayo de Transcripción de activación de los genes del sistema inmune Para visualizar toscamente activación inmune después de la infección, infectar moscas transgénicas que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor de un gen de péptido antimicrobiano como se describe anteriormente. 18 Ver las moscas infectadas debajo de un microscopio de fluorescencia capaz; Inducción GFP debe convertirse visible en el cuerpo de grasa dentro de la primera 6-10 horas después de la infección. Para la cuantificación más precisa de la activación inmune, utilizar PCR cuantitativa a la plantilla de cDNA (qRT-PCR) para medir la abundancia de las transcripciones de genes antimicrobianos péptido. NOTA: La expresión de genes inmunes se puede medir en cualquier momento después de la infección (o antes). Hablando en general, la inducción de la expresión génica inmune comienza aproximadamente 4 hr después de la inyección y aumenta durante el próximo 24 hr. Anestesiar moscas utilizando CO 2. Coloque 15 moscas en un tubo de microcentrífuga para cada extracción de RNA. NOTA: Se recomienda para recoger al menos tres muestras replicadas para cada condición de tratamiento. Extracto de ARN de las moscas y generar primera cadena de ADNc utilizando cualquiera de una serie de procedimientos estándar o kits comerciales. ARN tienda a -80 ° C. ADNc tienda a -20 ° C por períodos de unas pocas semanas y a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Antes de la extracción de RNA, tienda de fse encuentra a -80 ° C. Realizar PCR cuantitativa (qPCR) en los genes diana de interés utilizando el ADNc como plantilla. Consulte la Tabla 1 para las secuencias de cebadores para amplificar los genes de péptidos antibacterianos Diptericin A, Drosomycin, defensinas, Attacin A y Metchnikowin así como la rp49 gen de control de limpieza (también conocido como RPL32). NOTA: Los genes que codifican los péptidos antimicrobianos Diptericin A y Drosomycin proporcionan muy buenas lecturas de D. melanogaster actividad inmune inducida principalmente a través de las vías del IMD y de peaje, respectivamente. Con el fin de controlar la variación de muestra a muestra en el rendimiento de ARN y la eficiencia de la transcripción reversa, estandarizar la expresión de genes diana registrado contra un gen de mantenimiento de referencia cuya expresión no se espera que cambie con la infección tales como rp49 (también conocidos como RPL 32). Analizar los datos. <ol> Para aproximación de las diferencias de expresión, calcular la relación de la cantidad de partida (SQ) valor obtenido a partir del gen de ensayo (por ejemplo, Diptericin A) en relación con el valor SQ obtenido a partir del gen de referencia (por ejemplo, rp49) para cada muestra (calculado como SQ – DPTA / SQ – rp49). Escala estos ratios a un tratamiento de control de línea de base, tales como un control de manejo no infectada. Fijar arbitrariamente el nivel de expresión de control igual a 1,0 y visualizar tratamientos experimentales como cambios veces relativos. Estimar el valor SQ para cada gen frente a una curva estándar generada a partir de una serie de dilución de cDNA conocida en la cantidad. NOTA: El análisis estadístico de las relaciones puede ser complicado, por lo que este enfoque es mejor para aproximación rápida que para un análisis riguroso. Si la eficiencia de PCR es baja, el diseño de nuevos cebadores para mejorar la cinética de la PCR, si es posible. Para las reacciones de qPCR con eficiencia casi perfecta (adoubling de producto de PCR en cada ciclo), el ciclo umbral (C T) puede ser sustituido por el valor SQ. Para los experimentos simples con amplificación óptimamente eficiente, los datos pueden ser analizados usando el método ΔΔC T. 19 Para cada muestra, restar el valor C T del gen de referencia (por ejemplo, rp49) de la C T del gen de ensayo (por ejemplo., Diptericin A) para producir un? C T. Luego reste la T? C del control de línea de base de la T? C para cada muestra experimental para producir un valor ΔΔC T para cada muestra; este ΔΔC T es indicativo de diferencias relativas en los niveles de expresión génica entre los tratamientos, donde 2 (-ΔΔCT) se aproxima el cambio veces en la expresión. NOTA: Este análisis mal puede desestimar plegable cambio en la expresión del gen diana si la PCR el gen de prueba o la referenciagen tiene una baja eficiencia. Para el análisis más riguroso, llevar a cabo análisis de varianza (ANOVA) utilizando la expresión estimado del gen de ensayo (por ejemplo Diptericin A) como la variable de respuesta y expresión estimado del gen de control (por ejemplo, rp49) y otros factores experimentales como variables explicativas. NOTA: Este enfoque es relativamente robusto a la ineficiencia en la amplificación por PCR y permite el análisis de los más complicados diseños experimentales.