Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em> Drosophila melanogaster</em

1. Sammeln und Vorbereiten Flies Rück D. melanogaster unter den gewünschten experimentellen Bedingungen. Darauf achten, dass die Fliegen während der Aufzucht überladen und stellen Sie sicher, dass Larvendichten sind konsistent über Behandlungen, da Umgebungsbedingungen während des Larvenstadiums kann tief im erwachsenen Stadium Einfluss auf die Immunabwehr Phänotypen. 15 Sammeln experimentellen Fliegen 0-3 Tage nach dem Schlüpfen aus der Puppenhülle und übertragen diese auf frisches Medium. Haus die gesammelten Fliegen auf einer gewünschten Temperatur (Temperaturen zwischen 22 ° C und 28 ° C sind in der Regel nicht geeignet), bis sie alt sind 5-7 Tage nach dem Schlüpfen. HINWEIS: Dies ermöglicht genügend Zeit für die Fliegen zu Metamorphose zu vollenden und zu reifen Erwachsenen, sondern auch vor dem Altern beginnt. Die gewünschte Anzahl von Fliegen zu sortieren in einen separaten Fläschchen vor der Infektion, wieder darauf achten, dass Überfüllung zu vermeiden. HINWEIS: Nur males sind in dieser Demonstration infiziert ist aber ebenso möglich, Weibchen mit dem beschriebenen Verfahren zu infizieren. 2. Bereiten Sie Kultur und Bakterien Bereiten Sie eine Masterplatte der ausgewählten Bakterien mindestens 2 Tage vor der Infektion. Streak die Bakterien von einem 15% Glycerin Bestand auf unbegrenzte Zeit bei -80 ° C gelagert. Bewahren Sie die Master-Platte bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. Immer streak die Masterplatten direkt aus dem gefrorenen Glycerin Lager. Vermeiden serielle Passage von Bakterien von Platte zu Platte, als wiederholte Passage in Kultur kann dazu führen, Bakterien abgeschwächte Virulenz entwickeln. Hinweis: Dieses Beispiel macht von Providencia rettgeri und Escherichia coli. Gehen Sie folgendermaßen vor, um eine Bakteriensuspension zur Injektion vorzubereiten. Wachsen einem 2 ml Bakterienkultur durch Impfen steriles Medium mit einer Einzelkolonie von der Master-Platte isoliert. Wachsen die Bakterien bis zur stationären Phase (zB </em> O / N Wachstum bei 37 ° C). HINWEIS: Sowohl P. rettgeri und E. coli wachsen gut in Luria Broth bei Temperaturen von 20 bis 37 ° C unter leichtem Schütteln. Sobald die Kultur die stationäre Phase erreicht, pelletieren sanft Zellen von ca. 600 & mgr; l der Kultur in einer Tischzentrifuge (3 min bei 5000 × g), der Überstand verworfen, und die Bakterien zu resuspendieren in ca. 1.000 & mgr; l steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 PO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH = 7,4). Verdünne die resuspendierten Zellen in sterilem PBS auf eine optische Dichte (OD) für das Bakterium falls verwendet wird, mit einem Spektrophotometer als die Absorption bei 600 nm gemessen, zu erreichen. Mit dieser Suspension, um die Fliegen zu infizieren. HINWEIS: A 600 = 0,1 oder 1,0 entspricht jeweils etwa 10 8 und 10 9 Providencia rettgeri oder E. coli pro ml. Da beide leben einnd toten Bakterien beitragen, optische Dichte, ist es wichtig, in den frühen Kulturen der stationären Phase geerntet, bevor Bakterienleichen ansammeln und zu verzerren, das die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der lebensfähigen Bakterien während der Infektion eingebracht. 3. infizieren den Flies HINWEIS: Wie Drosophila Immunität durch zirkadianen Rhythmus beeinflußt, ist es wichtig, um Infektionen bei einer ähnlichen Tageszeit in Experimentwiederholungen durchführen 16. 3.1) mit Nanoinjector Bereiten Sie die Glasnadeln für eine Infektion. Bereiten Sie eine Glasnadel durch Ziehen eines Borosilikatglas Kapillare mit einer Mikropipette Abzieher. Mit einer Pinzette, brechen Sie die Spitze der Nadel, um eine Öffnung von ca. 50 & mgr; m Durchmesser zu schaffen, um den Ausstoß von Flüssigkeit zu ermöglichen. Montieren Sie den Injektor. Setzen Sie den O-Ring-Abdichtung und dann die weiße spacer (große Grübchen nach außen) auf die Metall Kolben. Füllen Sie das Glas Nadel mit Mineralöl mit einer Spritze mit einer 30-G-Nadel. Den gefüllten Glas Nadel durch die Spannzange und platzieren Sie den größeren O-Ring um seine Basis, etwa 1 mm von dem stumpfen Ende der Nadel dann. Schieben Sie die Nadel auf die Metallkolben und vorsichtig aufschrauben, bis der Spannzange sicher. Auswerfen meisten des Mineralöls aus dem Injektor, aber sicherzustellen, dass noch eine geringe Menge an Öl in der Nadel, um als Barriere zwischen dem Injektor und der Bakteriensuspension einwirken. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Mineralöl oder Bakteriensuspension, oder zwischen den beiden Flüssigkeiten. Stellen Sie den Injektor auf das gewünschte Volumen für die Injektion (zwischen 9 und 50 nl nl). Generieren Verwundung Kontrollen. Füllen der Düsennadel mit sterilem PBS durch vorsichtiges Einführen der Spitze der Kapillarnadel in einer Röhre der Medien und pressing auf die Schaltfläche "füllen" auf dem Injektor. HINWEIS: Sterile bakterielle Wachstumsmedien können auch eine verletzte Kontrolle verwendet werden, wenn das Experiment erfordert Injektion von Bakterien in ihrem Wachstumsmedium suspendiert. Da bakterielle Wachstumsmedien enthält Komponenten, die das Immunsystem stimulieren oder andere Effekte auf die Wirts kann, ist jedoch eine inerten Träger wie PBS bevorzugt. Anaesthetize die gewünschte Anzahl der Fliegen unter einem Lichtstrom von CO 2. Injizieren Sie die Fliegen in der vorderen Unterleib auf der ventrolateralen Oberfläche mit sterilem PBS. Hinweis: Es ist auch möglich, Fliegen an anderen Stellen, wie beispielsweise die sternopleural Platte des Thorax zu injizieren, aber es ist wichtig, um die Injektionsstelle konsistent in jedem Experiment halten 17. Zeigen injizierten Fliegen in frische Röhrchen mit neuen Medium, über die Fläschchen auf ihrer Seite, bis alle Fliegen aus der Narkose erholt haben, um die Fliegen aus immer auf das Essen stecken zu verhindern. <br /> Hinweis: Es wird empfohlen, die PBS Kontrollfliegen vor der Injektion Bakterien experimentellen Fliegen so die gleiche Nadel kann für beide Behandlungen verwendet werden, zu injizieren. Es wird nicht immer möglich sein, die gleiche Nadel für eine ganze Experiment zu verwenden. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, aufzuzeichnen, welche Nadel verwendet wurde, mit dem Fliegen und Nadel Identität als experimentelle Faktor in der statistischen Analyse einzuschließen. Spritzen Sie die bakteriellen Erreger. Werfen Sie die restlichen sterilen Medien aus dem Injektor und füllen Sie die gleiche Nadel mit der Bakteriensuspension. Das obige Verfahren (3.1.3), jetzt die Injektion die Fliegen mit der Bakteriensuspension in Verfahren 2.2 vorbereitet. 3.2) mit septischem Pinprick Bereiten Sie die Nadel zum Einstechen. Schmelzen Sie das Ende einer 200 ul Mikropipettenspitze und legen Sie eine 0,15 mm Insekten minutien Stift in die Kunststoffschmelze. Lassen Sie den Kunststoff zu verfestigen, such, dass der Stift an Ort und Stelle mit ungefähr 0,5 cm von Stift, der sich aus dem Kunststoff gehalten werden. Generieren Verwundung Kontrollen. Anaesthetize die gewünschte Anzahl der Fliegen unter einem Lichtstrom von CO 2. Stechen Sie die Fliegen in der sternopleural Platte des Thorax mit der Nadel, die Vermeidung der Befestigungsstellen der Flügel und Beine. Falls erforderlich, entfernen Sie vorsichtig entfernt vom minutien Stift mit weichem Pinzette. . HINWEIS: Es ist auch möglich, um die Fliegen an anderen Stellen, beispielsweise der vorderen Unterleib auf dem ventrolateralen Oberfläche zu stechen, aber es ist wichtig, die Injektionsstelle konsistent innerhalb jedes Experiments halten 17 Stechen durch die Kutikula des Bauches offenbar stärker schwieriger als Stechen des Thorax und ist daher weniger häufig. Legen Sie die gestochen Fliegen in eine frische Flasche mit neuen fly Medium, über das Fläschchen auf seiner Seite, bis alle Fliegen aus der Narkose erholt haben, um die Fliegen aus zu verhindernkommen, um die Lebensmittel stecken. Einführung der bakteriellen Infektion. Anaesthetize die gewünschte Anzahl der Fliegen unter einem Lichtstrom von CO 2. Stechen Sie jedes Haar in der gleichen Position wie die Mediensteuerung, Eintauchen der Spitze des Stifts in die Bakteriensuspension in Verfahren 2.2 vor stechen jede Fliege vorbereitet. Legen Sie die gestochen Fliegen in eine frische Flasche mit neuen fly Medium, über das Fläschchen auf seiner Seite, bis alle Fliegen sind aus der Narkose erholt, um die Fliegen aus immer auf das Essen stecken zu verhindern. 3.3) Bewertung der Infektionsdosis Lieferung Infizieren eine Reihe von Fliegen, wie oben in beiden Verfahren 3.1 oder 3.2 nur anstatt die Fliegen auf Nahrung Fläschchen aus der Narkose erholen beschrieben, legen Sie jeweils Fliegen in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Fügen Sie 250 ul PBS in jedes Röhrchen und homogenisieren die Fliegen entweder unter Verwendung von Stößel oder einen Wulst beater. </Li> Platte des Homogenats auf einer LB-Agarplatte, entweder unter Verwendung eines Spiralplattierers oder eine serielle Verdünnung. An der Platte mit Verdünnungsreihe, übertragen jede Fliege Homogenat zu der ersten Reihe einer 96-Well-Platte. Füllen jeder Vertiefung der restlichen Zeilen mit 90 ul PBS. Mit einer Mehrkanal Pipette 10 ul von der ersten Zeile mit Fliegen Homogenat und verzichten in der zweiten Reihe. Pipette nach oben und unten mindestens 10-mal, um gründlich zu mischen, und dann 10 & mgr; l und Transfer in der dritten Reihe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Zeilen. Ausgehend von der unteren Reihe (die meisten verdünnten Bakteriensuspension), verwenden Sie die Mehrkanalpipette bis 10 & mgr; l aus jeder Vertiefung und sich auf eine LB-Platte nehmen, darauf achten, dass die Proben als diskrete Flecken, die sich nicht gegenseitig berühren verzichtet. Wiederholen, bis alle Vertiefungen haben aus jeder Zeile abgetastet worden, Abgabe in absteigender Reihenfolge der Verdünnung auf der LB-Platte. </li> Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur, bis die Flecken vollständig in die LB-Platte eingeweicht. ANMERKUNG: Das Trocknen der LB-Platte für ein paar Tage bei RT vor der Verwendung wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit leicht absorbiert wird, die Wahrscheinlichkeit einer Berührung zwischen Probenflecken minimiert wird. Inkubieren Sie die Platten O / N, kümmert sich nicht um die Platten so überwuchern Kolonien klein und diskret bleiben. HINWEIS: Je nach der bakteriellen Wachstumsmedium und Bruttemperatur verwendet wird, können Kolonien von endogenen Darmflora der Fliege abgeleitet schließlich auf der Platte erscheinen. Allerdings sind die meisten Bakterien, die für pathogene Infektion viel schneller wachsen als die Darmflora auf LB-Agar bei 37 ° C. Platten entfernen aus dem Inkubator, wenn die experimentellen Bakterien sichtbare Kolonien gewachsen (in der Regel 8 bis 12 h), aber vor Drosophila Darmflora Kolonien erscheinen (etwa 36 h). Für langsam wachsende experimentelle Bakterien, verwenden Sie eine selektiveAntibiotikum, das in der LB-Agar, alle Kolonien von der Darmflora zu entfernen. Die Anzahl der Kolonien pro Homogenat. Für Spiralplatten, zählen die Kolonien, die mit Hilfe eines automatisierten Kolonie-Zähler, der die bakterielle Belastung pro ml Homogenat der Grundlage der Anzahl und Position der Kolonien auf der Platte zu schätzen wachsen kann. HINWEIS: Spiral Zählungen genaueste wenn die Konzentration der Bakterien im Bereich von 5 x von 02 bis 05 Oktober x 10 4 Bakterien pro ml. Für Tüpfelplatten, manuell die Kolonien für jede Fliege aus welcher Verdünnung enthält 30 zählen – 300 Kolonien und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml original Homogenat. 4. Charakterisieren Hinterbliebeneninfektions Assay Sterblichkeit nach der Injektion. Linie infiziert Fliegen und verwundet Steuerelemente in frische Fläschchen und Aufrechterhaltung in einem Inkubator bei einer gewünschten Temperatur (25 ° C bei einem 12:12 light: Dunkel-Zyklus wird empfohlen). Legen Sie nicht mehr als 15 Fliegen in einer einzigen Ampulle so wird es schwierig, mehr als 15 Wohn Fliegen zählen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden und toten Fliegen täglich oder öfter, wenn angemessen. Um die Lebensmittelqualität zu gewährleisten, schlagen die Fliegen auf neue Lebensmittel auf einem regelmäßigen Zeitplan. Wenn das Fläschchen enthält nur Männer, übertragen sie an die frische Fläschchen alle drei Tage. Wenn das Fläschchen enthält Weibchen, übertragen an die frische Fläschchen alle zwei Tage, weil Larven Nachkommen die Nahrung zu verflüssigen, wodurch das Risiko, dass adulte Fliegen kann stecken bleiben und was zu überschätzen Sterberate aufgrund von Infektionen. Statistische Auswertung der Daten. Plot Überleben als Kaplan-Meier-Kurve, die die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum zu einem Messzeitpunkt nach der Injektion mit einem Log-Rank T überleben. 18 Für Überlebenskurven, die nicht kreuzen, führen paarweise Vergleiche anzeigt,est (auch als Mantel Cox Test) durchzuführen oder komplexere Analysen mit Hilfe eines Cox-Modell, das von mehreren Faktoren und ihre Wechselwirkungen übernehmen können. Überlebenskurven, die zu überqueren, führen Sie eine geschichtete Cox-Analyse. 17 5. Assay bakterielle Belastung nach der Infektion Messen Sie bakterielle Belastung. Zu einer vorgeschriebenen Zeit nach der Injektion wiederholt, das zur Bewertung infektiöse Dosis, um bakterielle Belastung über den Verlauf der Infektion zu bestimmen durch (siehe Protokoll 3.3). HINWEIS: Bei Verwendung der Spirale plater verdünnen Homogenate, so dass die Bakteriensuspension in einem Bereich von 1000 fällt – 100.000 Bakterien pro ml. Analysieren Sie die Daten. Wenn bakterielle Belastung ist nicht normal, entweder Transformation der Daten, um eine bessere Annäherung an eine Normalverteilung oder die Daten unter Verwendung von nicht-parametrischen statistischen Analyse (zB Mann-Whitney U-Test) zu analysieren. Verwenden Sie eine Box-Cox-Analyse, um find die optimale Transformation; natürlichen Logarithmus oder Base -10 log Transformationen sind oft wirksam. 19 Wenn die Daten ausreichend normal verteilt und es gibt nur zwei Behandlungen ist gegenüber, führen eine t -test, um zu bestimmen, ob die beiden Behandlungen ergeben unterschiedliche mittlere Bakterienbelastungen. Wenn es mehrere experimentelle Variablen oder andere potentiell prädiktive Faktoren, benutzen Varianzanalyse (ANOVA), um festzustellen, welche Faktoren signifikante Prädiktoren für bakterielle Belastung sind. 19 6. Assay Transkriptionsaktivierung des Immunsystems Genes Zur Aktivierung des Immunsystems nach Infektion grob zu visualisieren, zu infizieren transgene Fliegen, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines Promotors von einem antimikrobiellen Peptid exprimieren, wie vorstehend beschrieben. 18 Sehen Sie sich die infizierten Fliegen unter dem Fluoreszenzmikroskop-fähig; GFP Induktion sollte sich visible im Fettkörper innerhalb der ersten 6 bis 10 Stunden nach der Infektion. Für eine genauere Quantifizierung der Immunaktivierung, benutzen quantitative PCR auf cDNA-Matrize (qRT-PCR), um die Fülle der antimikrobiellen Peptids Gentranskripten messen. HINWEIS: Die Expression von Immungenen kann zu jeder Zeit nach (oder vor) der Infektion gemessen werden. Generell Induktion von Immun Genexpression beginnt etwa 4 Stunden nach der Injektion und steigt in den nächsten 24 Stunden. Betäuben entfernt unter Verwendung von CO 2. Platzieren Sie 15 Fliegen in ein Mikrozentrifugenröhrchen für jede RNA-Extraktion. HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens drei Parallelproben für jede Behandlung erhalten zu sammeln. Extrahieren von RNA aus den Fliegen und erzeugen Erststrang-cDNA unter Verwendung einer Anzahl von Standardverfahren oder kommerzielle Kits. Speicher RNA bei -80 ° C. Speicher cDNA bei -20 ° C für einen Zeitraum von ein paar Wochen und bei -80 ° C zur Langzeitlagerung. Vor der RNA-Extraktion, speichern fliegt bei -80 ° C. Führen quantitative PCR (qPCR) auf Zielgene von Interesse unter Verwendung der cDNA als Matrize. Siehe Tabelle 1 für die Primer-Sequenzen, um die antibakterielle Peptid-Gene Diptericin A, Drosomycin, Defensin, Attacin A und Metchnikowin sowie die Zimmerreinigung Kontrollgens rp49 (auch als rpL32 bekannt) zu verstärken. HINWEIS: Die Gene, die die antimikrobielle Peptide Diptericin A und Drosomycin codieren, sehr gute Positionsanzeigen von D. melanogaster Immunaktivität vor allem durch die IMD und Toll Wege induziert sind. Um von Probe zu Probe Variation der RNA-Ausbeute und die Effizienz der reversen Transkription zu steuern, zu standardisieren, die aufgezeichnet Expression von Zielgenen gegen eine Referenz Housekeeping-Gen, dessen Expression nicht zu erwarten, mit einer Infektion verändern, wie rp49 (auch als RPL bekannt 32). Analysieren Sie die Daten. <ol> Für grobe Approximation Expressionsunterschiede wird das Verhältnis des von dem Testgens erhaltenen Ausgangsgröße (SQ) Wert (zB Diptericin A) relativ zu dem von der Referenz Gen erhalten SQ Wert (zB rp49) für jede Probe (berechnet als SQ – DPTA / SQ – rp49). Skalieren Sie diese Verhältnisse zu einer Baseline Steuerbehandlung, wie einem nicht infizierten Kontroll Handhabung. Willkürlich die Steuerexpressionsniveau gleich 1,0 eingestellt und zu visualisieren experimentelle Behandlungen als relative fache Veränderungen. Schätzen Sie die SQ-Wert für jedes Gen gegen eine Standardkurve aus einer Verdünnungsreihe von bekannten cDNA-Menge erzeugt. HINWEIS: Die statistische Analyse der Verhältnisse kann kompliziert sein, so ist dieser Ansatz besser für die schnelle Annäherung als für strenge Analyse. Wenn PCR Effizienz gering, entwerfen neue Primer, um, wenn möglich, PCR-Kinetik verbessern. Für qPCR Reaktionen mit nahezu perfekte Effizienz (adoubling des PCR-Produkts in jedem Zyklus) kann die Schwellenzyklus (C T) für die SQ-Wert ersetzt werden. Für einfache Experimente mit optimal effiziente Amplifikation können Daten unter Verwendung des ΔΔC T-Verfahren analysiert werden. 19 Für jede Probe subtrahieren die C T -Wert des Referenzgens (zB rp49) aus dem C T des Testgens (z. B. Diptericin A), um eine & Delta; C T zu erhalten. Dann ziehen Sie die & Delta; C T der Grundlinie Steuer vom & Dgr; C T für jede Versuchsprobe, eine ΔΔC T-Wert für jede Probe zu erhalten; Diese ΔΔC T anzeigt relativen Unterschiede der Genexpression zwischen den Behandlungen, wobei 2 (-ΔΔCT) approximiert die fache Veränderung der Expression. ANMERKUNG: Diese Analyse kann schlecht misestimate-fache Veränderung der Expression des Zielgens, wenn die PCR entweder des Test-Gens oder des ReferenzGen hat geringe Effizienz. Für den strengsten Analysen kann Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der geschätzten Expression des Testgens (zB Diptericin A) als Reaktionsvariable und der geschätzten Expression des Kontrollgens (zB rp49) und andere experimentelle Faktoren als erklärende Variablen. HINWEIS: Diese Vorgehensweise ist relativ robust zu Ineffizienz in der PCR-Amplifikation und ermöglicht Analyse komplizierter experimentellen Designs.