Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em> Drosophila melanogaster</em

1. Recolha e Preparação Flies D. Traseira melanogaster sob as condições experimentais desejados. Tome cuidado para não sobrecarregar as moscas durante a criação e certifique-se que as densidades larvais são consistentes entre os tratamentos, uma vez que as condições ambientais durante a fase larval pode afetar profundamente fenótipos de defesa imunológica durante a fase adulta. 15 Recolha moscas experimentais 0-3 dias após a eclosão do caso de pupa e transferi-los para meio fresco. Casa das moscas recolhidos a uma temperatura desejada (temperaturas entre 22 ° C e 28 ° C são geralmente adequadas) até que eles são envelhecidos 5-7 dias pós-eclosão. NOTA: Isto permite tempo suficiente para que as moscas para completar a metamorfose e se tornam adultos maduros, mas é bem antes de senescência começa. Organizar o número desejado de moscas em um frasco separado antes da infecção, mais uma vez tendo o cuidado de evitar a superlotação. NOTA: Apenas males estão infectados nesta demonstração, mas é igualmente possível infectar fêmeas usando o procedimento descrito. 2. Prepare Cultura e bactérias Prepara-se uma placa mestre das bactérias escolhidas pelo menos 2 dias antes da infecção. Streak as bactérias de um stock de glicerol a 15% armazenadas indefinidamente a -80 ° C. Armazenar a placa principal, a 4 ° C durante até 2 semanas. Sempre raia das placas principais diretamente a partir do estoque de glicerol congelado. Evite passagem em série de bactérias de placa para placa, como passagem repetida em cultura pode causar bactérias a evoluir virulência atenuada. NOTA: Este exemplo faz uso de Providencia rettgeri e Escherichia coli. Use o seguinte procedimento para preparar uma suspensão bacteriana para injecção. Crescer uma cultura de 2 mL das bactérias por inoculação de meio estéril com uma única colónia isolada a partir da placa mestre. Deixar crescer as bactérias a fase estacionária (por exemplo, </em> O / N de crescimento a 37 ° C). NOTA: Tanto P. rettgeri e E. coli crescer bem no caldo de Luria, a temperaturas 20-37 ° C com agitação suave. Uma vez que a cultura atingiu a fase estacionária, suavemente sedimentar as células de aprox. 600 ul da cultura em uma centrífuga de mesa (3 min a 5000 xg), descartar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em aprox. 1000 ul de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 PO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH = 7,4). Diluir as células ressuspensas em PBS estéril para obter uma densidade óptica (OD) adequado para a bactéria a ser utilizado, medida com um espectrofotómetro como a absorvância a 600 nm. Utilizar esta suspensão para infectar as moscas. NOTA: A 600 = 0,1 ou 1,0, respectivamente, corresponde a cerca de 10 8 e 10 9 Providencia rettgeri ou E. coli por ml. Porque ambos viver umaND bactérias mortas contribuir para a densidade óptica, é importante para a colheita precoce culturas em fase estacionária antes cadáveres bacterianas acumular e distorcer a relação entre a densidade óptica e o número de bactérias viáveis ​​introduzidas durante a infecção. 3. infectar as moscas NOTA: Como a imunidade Drosophila é influenciada por ritmo circadiano, é importante realizar infecções em um momento semelhante de dia através repetições experimentais 16. 3.1) Usando um Nanoinjector Preparar as agulhas de vidro para a infecção. Prepare uma agulha de vidro, puxando um capilar de vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta. Usando fórceps, parta a ponta da agulha para criar uma abertura de cerca de 50 um de diâmetro para permitir a ejecção de líquido. Monte o injector. Inserir o O-ring de vedação e, em seguida, o sp brancoacer (grande ondulação virado para fora) no êmbolo de metal. Encher a agulha de vidro com óleo mineral usando uma seringa com uma agulha 30 G. Coloque a agulha de vidro cheio através da pinça e, em seguida, coloque o maior anel de vedação em torno de sua base, cerca de 1 mm a partir da extremidade cega da agulha. Deslize a agulha para o êmbolo de metal e suavemente aperte a pinça até seguro. Ejectar a maior parte do óleo mineral a partir do injector, mas tornar-se que ainda existe um pequeno volume de óleo no interior da agulha para actuar como uma barreira entre o injector e a suspensão bacteriana. Certifique-se de que não existem bolhas de ar dentro do óleo mineral ou suspensão bacteriana, ou entre os dois líquidos. Definir o injector ao volume desejado para injecção (entre 9 e 50 nl nl). Gerar ferindo controles. Preencha a agulha injector com PBS estéril, inserindo cuidadosamente a ponta da agulha capilar em um tubo de mídia e pressionar o botão "preencher" no injector. NOTA: Estéril meio de crescimento bacteriano também pode ser utilizado um controlo ferindo se a experiência requer injecção de bactérias em suspensão no seu meio de crescimento. No entanto, porque o meio de crescimento bacteriano contém componentes que podem estimular o sistema imunitário ou têm outros efeitos sobre o hospedeiro, um transportador inerte, tal como PBS é preferível. Anestesiar o número desejado de moscas sob um fluxo de luz de CO 2. Injectar as moscas no abdome anterior na superfície ventrolateral com o PBS estéril. NOTA: É também possível injectar moscas em outros locais, tais como a placa sternopleural do tórax, mas é importante para manter o local da injecção consistente dentro de cada experiência 17. Coloque moscas injectadas em frascos frescos com novo meio, que estabelece os frascos do seu lado até que todas as moscas se recuperaram da anestesia para evitar as moscas de tornar-se preso ao alimento. <br /> NOTA: Recomenda-se a injetar as moscas de controle PBS antes de injetar bactérias para moscas experimentais de modo a mesma agulha podem ser usados ​​para ambos os tratamentos. Não será sempre possível usar a mesma agulha para uma experiência inteira. Nesse caso, pode ser desejável para gravar agulha que foi utilizada com que moscas e para incluir a identidade da agulha como um factor experimental em análise estatística. Injectar o patógeno bacteriano. Ejetar a mídia estéril restante do injector e volte a encher a mesma agulha com a suspensão bacteriana. Repetir o procedimento acima (3.1.3), agora injectando as moscas com a suspensão bacteriana preparada no procedimento 2.2. 3.2) Com fossa séptica Pinprick Prepare a agulha para picar. Derreter o final de uma ponta de micropipeta de 200 ul e inserir um pino de 0,15 milímetros de insectos minutien no plástico fundido. Permitir que o plástico para solidificar suCH que a cavilha é mantida no lugar com aproximadamente 0,5 cm de pinos que se estendem a partir do plástico. Gerar ferindo controles. Anestesiar o número desejado de moscas sob um fluxo de luz de CO 2. Picar as moscas na placa sternopleural do tórax com a agulha, evitando os locais de fixação das asas e as pernas. Se necessário, remover suavemente moscas do pino minutien usando uma pinça macios. NOTA:. 17 Pricking através da cutícula do abdómen É também possível para picar as moscas em outros locais, tais como o abdómen anterior sobre a superfície ventrolateral, mas é importante para manter o local da injecção consistente dentro de cada experiência tende a ser mais difícil do que picar do tórax e por isso é menos comum. Coloque as moscas picavam em um novo frasco com novo meio mosca, colocando o frasco de lado até que todas as moscas se recuperaram da anestesia para impedir que as moscas de bevinda preso ao alimento. Introduzir a infecção bacteriana. Anestesiar o número desejado de moscas sob um fluxo de luz de CO 2. Prick cada voar no mesmo local que os controles de mídia, mergulhando a ponta do alfinete na suspensão bacteriana preparada no procedimento 2.2 antes de picar cada mosca. Coloque as moscas picavam em um novo frasco com novo meio mosca, colocando o frasco de lado até que todas as moscas se recuperaram da anestesia para impedir que as moscas de tornar-se preso ao alimento. 3.3) Avaliar a dose infecciosa Proferido Infect um conjunto de moscas como descrito acima no procedimento ou 3.1 ou 3.2, só que em vez de retornar as moscas ao frasco comida para recuperar da anestesia, colocar cada voar para um tubo de microcentrifugadora em gelo. Adicionar 250 ul de PBS a cada tubo e homogeneizar as moscas quer utilizando um pilão ou um batedor de esferas. </Li> Placa do homogenato numa placa de agar LB, quer utilizando uma placa em espiral ou uma diluição em série. Para placa utilizando diluição em série, transferir cada homogeneizado mosca para a primeira linha de uma placa de 96 poços. Encher cada poço das restantes linhas, com 90 ul de PBS. Usando uma pipeta multicanal, tomar 10 ml da primeira linha contendo voar homogeneizado e dispensar na segunda fila. Pipeta cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem, e em seguida, tomar 10 ul e transferir para a terceira fila. Repita este procedimento com as restantes linhas. A partir da linha inferior (mais diluída bactérias suspensão), use a pipeta multicanal para tomar 10 ml de cada poço e depósito em uma placa de LB, tendo o cuidado de que as amostras são dispensados ​​como pontos discretos que não se tocam. Repita até que todos os poços foram amostrados de cada linha, dispensando-os em ordem decrescente de diluição na placa LB. </li> Deixar a placa à temperatura ambiente até que as manchas têm completamente embebido na placa de LB. NOTA: A secagem da placa LB durante alguns dias à temperatura ambiente antes da sua utilização é recomendada para assegurar que o líquido é rapidamente absorvido, minimizando a possibilidade de contacto acidental entre pontos de amostra. Incubar as placas O / N, tomando cuidado para não cobrir as placas de modo colônias permanecem pequeno e discreto. NOTA: Dependendo do meio de crescimento e incubação à temperatura bacteriana utilizada, as colónias derivadas de endógeno microbiota do intestino da mosca pode eventualmente aparecer no prato. No entanto, a maioria das bactérias utilizadas para a infecção patogénica crescer muito mais rapidamente do que a microbiota intestinal em agar LB a 37 ° C. Retirar as placas da incubadora quando as bactérias experimentais cresceram colónias visíveis (normalmente 8-12 horas), mas antes de Drosophila colônias microbiota intestinal aparecer (aproximadamente 36 horas). Para crescentes bactérias experimentais lentas, utilize um selectivoantibiótico no agar LB para remover quaisquer colónias a partir da flora intestinal. Contar o número de colónias de cada homogeneizado. Para placas de espiral, conte as colônias que crescem utilizando um contador de colónias automatizado que pode-se estimar a carga bacteriana por ml de homogeneizado com base no número e posição das colônias na chapa. NOTA: contagens em espiral são mais precisa, quando a concentração de bactérias é, no intervalo de 5 x10 2 a 5 x 10 4 bactérias por ml. Para placas no local, contar manualmente as colônias para cada mosca a partir de qualquer diluição contém 30-300 colônias e calcular o número de bactérias por ml de homogeneizado originais. 4. Caracterizar Survivorship de Infecção Ensaio de mortalidade pós-injeção. Coloque moscas infectadas e controlos feridos em frascos frescos e manter numa incubadora a uma temperatura desejada (25 ° C, com um lig 12:12ht: Recomenda ciclo escuro). Não coloque mais de 15 moscas em um único frasco, uma vez que torna-se difícil contar mais de 15 moscas de vida. Contar o número de vivos e mortos moscas a cada dia, ou mais frequentemente, se for caso disso. A fim de manter a qualidade dos alimentos, virar as moscas ao novo alimento em uma programação regular. Se o frasco para injectáveis ​​contém apenas os machos, transferi-los para frascos frescos a cada três dias. Se o frasco para injectáveis ​​contém fêmeas, a transferência para frascos frescos a cada dois dias porque progênie larval vai liquefazer o alimento, aumentando o risco de que as moscas adultas podem ficar preso e resultando em taxas de mortalidade superestimada devido à infecção. Estatisticamente analisar os dados. Sobrevivência trama como uma curva de Kaplan-Meier, o que indica a probabilidade de que um indivíduo vai sobreviver a um ponto de tempo após a injecção medido. 18 Para as curvas de sobrevivência que não atravessam, realizar comparações de pares usando um Log-Rank Test (também chamado de Mantel Cox Test) ou realizar análises mais complexas usando um dos perigos Modelo Cox proporcional, que pode incorporar vários fatores e suas interações. Para curvas de sobrevida que atravessam, realizar uma análise de Cox estratificado 17. 5. Coloque ensaio bacteriano infecção pós- Medir a carga bacteriana. Numa altura prescrita pós-injecção, repetir o procedimento utilizado para avaliar a dose infecciosa para determinar a carga bacteriana durante o curso da infecção (ver protocolo 3.3). NOTA: Se utilizar a placa em espiral, dilui-se homogeneizados de modo a que a suspensão bacteriana cai dentro de uma gama de 1.000 – 100.000 bacteriana por ml. Analisar os dados. Se a carga bacteriana é não-normal, ou transformar os dados para melhor aproximar uma distribuição normal ou analisar os dados utilizando análise estatística não paramétrica (por exemplo, teste de Mann-Whitney U Test). Use uma análise Box-Cox para find a transformação ideal; log natural ou de base -10 transformações de log geralmente são eficazes 19. Se os dados são suficientemente normalmente distribuídos e há apenas dois tratamentos serem contrastados, realizar um teste t para determinar se os dois tratamentos resultar em diferentes cargas bacterianas médios. Se houver várias variáveis ​​experimentais ou outros fatores potencialmente preditivos, use análise de variância (ANOVA) para determinar quais fatores são preditores significativos de carga bacteriana 19. 6. Ensaio da transcrição activação de genes do sistema imunitário Para visualizar grosseiramente activação imune após a infecção, infectar moscas transgénicas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo de um promotor de um gene do péptido antimicrobiano, tal como descrito anteriormente. 18 Ver as moscas infectadas sob um microscópio de fluorescência com capacidade; Indução GFP deve tornar-se visible no corpo de gordura no interior da primeira 6-10 horas após a infecção. Para a quantificação mais precisa da activação imunitária, utilizar PCR quantitativo em molde de ADNc (qRT-PCR) para medir a abundância de transcritos de genes de péptidos antimicrobianos. NOTA: A expressão dos genes do sistema imunológico pode ser medido em qualquer momento após a infecção (ou antes). De um modo geral, a indução da expressão do gene imunitário começa cerca de quatro horas após a injecção e aumenta durante as próximas 24 horas. Anestesiar moscas usando CO 2. Coloque 15 moscas em um tubo de microcentrífuga para cada extração de RNA. NOTA: Recomenda-se a coletar pelo menos três amostras idênticas para cada condição de tratamento. Extracto de RNA da moscas e gerar ADNc de primeira cadeia usando qualquer um de uma série de procedimentos padrão ou kits comerciais. ARN Armazenar a -80 ° C. ADNc Armazenar a -20 ° C durante períodos de algumas semanas e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Antes da extração de RNA, loja de fencontra-se a -80 ° C. Executar PCR quantitativa (qPCR) em genes alvo de interesse, utilizando o ADNc como molde. Consulte a Tabela 1 para as sequências de iniciadores para amplificar os genes de péptidos antibacterianos Diptericin A, Drosomycin, defensina, atacina A, e Metchnikowin, bem como o gene de controlo rp49 arrumação (também conhecido como rpL32). NOTA: Os genes que codificam os péptidos antimicrobianos Diptericin A e Drosomycin fornecer muito boas leituras de D. melanogaster atividade imunológica induzida principalmente pelas vias IMD e Toll, respectivamente. A fim de controlar a variação de amostra-a-amostra com um rendimento de ARN e a eficiência da transcrição reversa, padronizar a expressão de genes alvo gravada contra um gene de referência arrumação cuja expressão não se espera que altere com a infecção, tais como rp49 (também conhecidos como RPL 32). Analisar os dados. <ol> Por aproximação grosseira de diferenças de expressão, calcula o rácio entre o valor de quantidade de partida (SQ), obtido a partir do gene de teste (por exemplo, Diptericin A) em relação ao valor SQ obtida a partir do gene de referência (por exemplo, rp49) para cada amostra (calculado como SQ – DPTA / SQ – rp49). Escalar esses rácios para um tratamento de controle de linha de base, como um controle manipulação não infectado. Arbitrariamente definir o nível de expressão de controle igual a 1,0 e visualizar tratamentos experimentais como mudanças dobra relativos. Estimar o valor para cada gene SQ contra uma curva padrão gerada a partir de uma série de diluição de quantidade conhecida de ADNc. NOTA: A análise estatística dos rácios pode ser complicada, pelo que esta abordagem é melhor para a aproximação rápida do que para uma análise rigorosa. Se a eficiência da PCR é baixa, projetar novos primers para melhorar a cinética de PCR se possível. Para reações de qPCR com quase perfeita eficiência (adoubling de produto de PCR a cada ciclo), o ciclo limiar (C T) pode ser substituído pelo valor SQ. Para as experiências simples com amplificação optimamente eficaz, os dados podem ser analisados ​​usando o método ΔΔC t. 19 Para cada amostra, subtrair o valor de C T o gene de referência (por exemplo, rp49) do C T do gene de teste (por exemplo., Diptericin A) para se obter um ôc T. Em seguida, subtrair o ôc T de controlo de linha de base a partir do ôc T para cada amostra experimental, para se obter um valor ΔΔC T para cada amostra; este ΔΔC T é indicativa de diferenças relativas nos níveis de expressão do gene entre os tratamentos, onde 2 (-ΔΔCT) se aproxima da mudança vezes na expressão. NOTA: Esta análise pode dobrar-mal desestimar mudança na expressão do gene alvo por PCR se o gene de qualquer teste ou de referência agene tem baixa eficiência. Para a análise mais rigorosa, conduzir a análise de variância (ANOVA), utilizando a expressão estimada do gene de teste (por exemplo, Diptericin A) como variável de resposta e expressão estimado do gene de controlo (por exemplo, rp49) e outros factores experimentais como variáveis ​​explanatórias. NOTA: Esta abordagem é relativamente robusta a ineficiência na amplificação por PCR e permite a análise de projetos experimentais mais complicadas.