全身細菌感染や免疫防御表現型<em>キイロショウジョウバエ</em

1.ハエを収集し、準備しますリアD.希望の実験条件下でメラノ 。飼育中にハエが混雑し、幼虫期中の環境条件が深く大人の段階で免疫防御表現型に影響を与えることができるので、幼虫密度は、治療間で一貫していることを確認してくださいしないように注意してください。15 蛹のケースから3日後に羽化し、新鮮な培地にそれらを転送する – 0実験ハエを収集します。 ポスト羽化7日 – 彼らは5歳になるまで家は、所望の温度で収集したハエは（22℃と28℃の間の温度は、一般的に適切です）。 注：これは変態を完了し、成熟した大人になるためのハエのための十分な時間を可能にするが、老化が始まる前によくあります。 再び過密を避けるように注意しながら、感染前に別のバイアルの中にハエの希望数を並べ替えます。 注：唯一のMAレこのデモで感染が、記載された手順を用いて、女性に感染することも可能であるしています。 2.文化や細菌を準備少なくとも2日間感染前に選択された細菌のマスタープレートを準備します。ストリーク-80℃で無期限に保存された15％のグリセロールストックからの細菌。 2週間まで4℃でのマスタープレートを保管してください。常にストリーク凍結グリセロールストックから直接マスタープレート。文化の中で繰り返される通路は、細菌が弱毒性を進化させることができるように、プレートにプレートからの細菌の連続継代を避けます。 注：この例では、 プロビデンシアrettgeri大腸菌を利用します。 注射のために細菌懸濁液を準備するために、次の手順を実行します。 マスタープレートから単離された単一コロニーを滅菌培地に接種することにより、細菌の2ミリリットルの文化を育てます。 例えば （固定相への細菌を育てます</em37℃で> O / Nの増加）。 注：両方のP.穏やかに振盪しながら37℃ – rettgeri、大腸菌は 20の温度でルリアブロスでよく育ちます。 培養が定常期に達した後、緩やかに約から細胞をペレット化。卓上遠心分離機での培養の600μlの（5,000×gで3分間）、上清を捨て、そして約内の細菌を再懸濁します。滅菌リン酸緩衝生理食塩水1,000μL（PBS; 137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa 2 PO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH値= 7.4）。 600 nmの吸光度として分光光度計で測定使用される細菌のための適切な光学密度（OD）を達成するために、滅菌PBS中で再懸濁した細胞を希釈します。ハエに感染させるためにこの懸濁液を使用します。 注：600 = 0.1または1.0は、約10 8〜10 9 プロビデンシアrettgeriまたはEにそれぞれ対応します1ml当たり大腸菌 。両方が住んでいるのでND死菌は光学密度に貢献、それは細菌の死体が蓄積する前に、初期の定常期における培養を収穫し、光学密度および感染の間に導入された生菌数との関係を歪曲することが重要です。 3.ハエに感染 NOTE： ショウジョウバエ免疫は概日リズムに影響されるように、それは実験の反復を横切る日の同様の時間で感染を行うことが重要である16。 3.1）ナノインジェクタを使用しました感染のためにガラス針を準備します。 マイクロピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーを引いて、ガラス針を準備します。 鉗子を使用して、液体の吐出を可能にするために約50ミクロンの直径の開口部を作成するために、針の先端を断ちます。 インジェクタを組み立てます。 シールOリング、次に白SPを配置エイサーは、金属プランジャー上に（大ディンプルは外側に向かって）。 30 G針と注射器を使用して、鉱物油とガラス針を埋めます。 コレットを介して充填されたガラス針を入れ、針の鈍端から約1mm、その基部の周りに大きなOリングを配置します。 金属プランジャ上に針をスライドさせ、ゆっくりと安全なまでコレットのネジ。 インジェクタからミネラルオイルのほとんどを取り出し、それでもインジェクタと細菌懸濁液との間の障壁として機能するように、針中の油の小容量があることを確認してください。空気の泡が鉱物油や細菌懸濁液中の、または二つの液体の間がないことを確認します。 （9 NLと50 NLの間の）注射のための所望の体積に注射器を設定します。 負傷のコントロールを生成します。 注意深く培地とpressiのチューブにキャピラリ針の先端を挿入することにより、滅菌PBSで注射器の針を塗りつぶしインジェクタの「塗りつぶし」ボタンをngの。 注記：この実験は、それらの増殖培地中に懸濁した細菌の注入を必要とする場合、滅菌細菌増殖培地はまた、創傷コントロールを使用することができます。細菌の増殖培地は、免疫系を刺激するか、ホスト上の他の効果を有することができる成分を含んでいるのでしかし、PBSなどの不活性担体が好ましいです。 CO 2の光の流れの下でハエの希望数を麻酔し。 滅菌PBSで腹外側表面上の前方腹部にハエを注入します。 注：これは、このような胸部のsternopleural板などの他の部位でのハエを注入することも可能であるが、それは各実験内で一貫注射部位を維持することが重要である17 ハエの全てまで、彼らの側にバイアルを敷設、新しいメディアとの新鮮なバイアルに注入したハエを置き、食品にこだわっなってからハエを防ぐために、麻酔から回復しました。<BR />注：これは、同じ針が両方の処置のために使用することができるように、実験的なハエへの細菌を注入する前に、PBS対照ハエを注入することをお勧めします。それは、常に全体の実験のために、同じ針を使用できないことがあります。その場合には、その統計的分析の実験因子として針IDを含むように飛ぶと一緒に使用した針を記録することが望ましい場合があります。 細菌性病原体を注入します。 インジェクタから残りの滅菌メディアを取り出し、細菌懸濁液と同じ針を補充します。 今の手順2.2で調製した細菌懸濁液でハエを注入し、上記の手順（3.1.3）を繰り返します。 3.2）浄化槽針を刺したと穿刺用の針を準備します。 200μlのマイクロピペットチップの先端を溶融し、溶融プラスチックに0.15ミリメートル昆虫minutienピンを挿入します。プラスチックはSUを固化することを許可しますピンがプラスチックから延びるピンの約0.5センチメートルで所定の位置に保持されているCH。 負傷のコントロールを生成します。 CO 2の光の流れの下でハエの希望数を麻酔し。 翼と脚の結合部位を避けて、針で胸部のsternopleural板でハエを刺します。必要に応じて、優しくソフトな鉗子を使用してminutienピンからハエを除去。 注：これは、このような腹外側表面上の前部腹部など他のサイト、でハエを刺すことも可能ですが、それは各実験内で一貫注射部位を維持することが重要である17腹部のクチクラを通して穿刺よりになる傾向があります胸部の刺すため、あまり一般的であるよりも難しいです。 ハエのすべてがBEからハエを防ぐために、麻酔から回復するまで、その側にバイアルを敷設、新しいフライ媒体を新鮮なバイアルに刺しハエを置き食品にこだわってきます。 細菌感染をご紹介します。 CO 2の光の流れの下でハエの希望数を麻酔し。 それぞれがそれぞれのフライを刺す前に、手順2.2で調製した細菌懸濁液にピンの先端を浸漬、メディアのコントロールと同じ場所に飛んで刺します。 その側にバイアルを敷設、新しいフライ媒体を新鮮なバイアルに刺しハエを置き、食品にこだわっなってからハエを防ぐために、麻酔から回復したハエの全てまで。 3.3）感染量は、配信を評価します手順3.1または3.2のいずれかに上記のようにハエのセットを感染のみの代わりに、麻酔から回復するために食品のバイアルにハエを返し、それぞれが氷上でマイクロ遠心チューブに飛んで配置します。 各チューブに250μlのPBSを加え、乳棒またはビーズビーターを使用してハエのいずれかを均質化します。</ LI> LB寒天プレート上にホモジネートをプレート、いずれかのスパイラルプレーターまたは連続希釈を使用して。 連続希釈を用いて、プレートに、96ウェルプレートの最初の行に、各フライホモジネートを転送します。 PBSの90μlの残りの行の各ウェルを埋めます。 マルチチャンネルピペットを使用して、ホモジネートを飛び、2行目に分配含む最初の行から10μLを取ります。 ピペットは、上下に少なくとも10回は、完全に混合し、その後、10μLを取り、3行目に転送します。残りの行を使用してこの手順を繰り返します。 一番下の行から（ほとんどの細菌懸濁液を希釈）、サンプルが互いに接触しない個別のスポットとして分配されることに注意しながら、各ウェルのLBプレート上の堆積物から10μLを取るためにマルチチャンネルピペットを使用しています。全てのウェルは、LBプレート上に希釈の降順にそれらを分配する、各行からサンプリングされるまで繰り返します。 </li> スポットは完全にLBプレートに浸漬するまで、室温でプレートにしておきます。 注：使用前に室温で数日間LBプレートの乾燥は、サンプルスポットとの間の偶発的な接触の可能性を最小限に抑え、液体を容易に吸収されていることを確認することをお勧めします。 コロニーは小さく、個別の残るようにプレートを過剰成長しないように注意しながら、O / N培養します。 注：使用する細菌の増殖培地およびインキュベーション温度に依存して、ハエの内因性の腸内細菌叢から由来するコロニーは、最終的にプレートに表示されることがあります。しかし、病原性の感染のために使用されるほとんどの細菌は、37℃でLB寒天上腸内微生物叢よりもはるかに速く成長します。 実験的細菌が見えるコロニー成長しているインキュベーターからプレートを取り外します（典型的には8から12時間）が、 ショウジョウバエ腸内細菌叢のコロニーは（約36時間）表示されるまでに。成長の遅い実験細菌については、選択を使用します腸内細菌叢から任意のコロニーを除去するLB寒天中の抗生物質。 各ホモジネートのためのコロニーの数を数えます。 スパイラルプレートは、プレート上のコロニーの数と位置に基づいてホモジネート1ml当たりの細菌負荷を推定することができる自動コロニーカウンターを用いて成長するコロニーをカウントします。 注：細菌濃度は、1mlあたり5×10 2〜4×10 5の細菌の範囲内にあるときにスパイラル数が最も正確です。 スポットプレートの場合は、手動で希釈が30含まれている方から、各フライ用のコロニーカウント – 300個のコロニーを、元のホモジネート1ml当たりの細菌の数を計算します。 感染の4特徴付けサバイバーアッセイ死亡後噴射。 12時12 LIGと新鮮なバイアルに感染したハエや負傷したコントロールを配置し、所望の温度のインキュベーターに維持する（25°CHT：暗サイクルを推奨）。それは15以上の生活ハエをカウントすることが困難になるような単一バイアルに15以上のハエを入れないでください。 毎日の生活と死んだハエの数をカウント、またはより頻繁に適切な場合。 、食品の品質を維持するため、定期的に新しい食べ物にハエを反転させるために。 バイアルは男性のみが含まれている場合は、3日ごとに新鮮なバイアルに移します。バイアルは、女性が含まれている場合は、幼虫の子孫が、その大人のハエが立ち往生し、感染による死亡の過大評価率をもたらすことができるリスクを増加させる、食品を液化しますので、2日ごとに新鮮なバイアルに移します。 データを統計的に分析します。 個人が測定された時点注射後に生存する確率を示すカプランマイヤー曲線としてプロット生存。交差しない生存曲線18は 、ログランクTを使用して対比較を行いますEST（もマンテルコックステストと呼ばれる）、または、いくつかの要因とその相互作用を組み込むことができるコックス比例ハザードモデルを使用して、より複雑な分析を行います。交差生存曲線については、成層コックス分析を行う。17 5.アッセイ細菌感染後のロード細菌負荷を測定します。 所定時間後の注射では、感染の過程で細菌負荷を決定するために、感染用量を評価するために使用される手順を繰り返し（プロトコル3.3を参照）。 注： – ミリリットル100,000細菌細菌懸濁液が1000の範囲内に収まるようにスパイラルプレーターを使用している場合、ホモジネートを希釈します。 データを分析します。 細菌負荷が非正常であれば、より良い正規分布に近似またはノンパラメトリック統計分析（ 例えば、マン·ホイットニーU検定）を使用してデータを分析するためにデータを変換するのいずれか。 FへのBox-Coxの分析を使用してください最適な変換をindは。自然対数またはベース-10ログ変換は、多くの場合、効果的である。19 データが十分に正常に配布され、対比されている唯一の2つの処理がされている場合は、2つの処理が異なる平均細菌負荷をもたらすかどうかを判断するためのt検定を行います。複数の実験的変数または他の潜在的予測因子が存在する場合、因子が細菌負荷の有意な予測因子であるかを決定するために分散分析（ANOVA）を使用。19 免疫系遺伝子の6アッセイ転写活性化粗感染後の免疫活性化を可視化するために、前述のように抗菌ペプチド遺伝子からのプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックハエを感染18 蛍光可能な顕微鏡下で感染したハエを見ます。 GFPの誘導はvisibになるべき感染後10時間 – 第6内の脂肪体でル。 免疫活性化のより正確な定量化のために、抗菌ペプチド遺伝子の転写産物の存在量を測定するために、cDNAテンプレート（定量RT-PCR）で定量PCRを使用しています。 注：免疫遺伝子の発現が（または前）感染後の任意の時点で測定することができます。一般的に言えば、免疫遺伝子発現の誘導は、次の24時間かけて注入し、増加した後、約4時間を開始します。 CO 2を使用してハエを麻酔。 各RNA抽出用のマイクロチューブに15ハエを置きます。 注：これは、各処理条件のために少なくとも3つの複製サンプルを収集することをお勧めします。 ハエからRNAを抽出し、標準的な手順または市販のキットのうちのいずれかを使用して、第一鎖cDNAを生成します。 -80℃で保存したRNA。数週間の期間のための-20℃での長期保存のための-80℃で保存したcDNA。 RNA抽出の前に、店舗F-80℃です。 cDNAをテンプレートとして使用して、目的の標的遺伝子の定量的PCR（定量PCR）を行います。抗菌ペプチド遺伝子Diptericin A、Drosomycin、デフェンシン、Attacin A、およびMetchnikowinならびに（もrpL32として知られている）のハウスキーピング制御遺伝子rp49を増幅するためのプライマー配列については表1を参照してください。 注：抗菌ペプチドDiptericin AとDrosomycinをコードする遺伝子は、Dの非常に良好な読み出しを提供しますそれぞれ、IMDとトール経路を介して、主に誘導された免疫活性をショウジョウバエ 。サンプル間のRNA収量の変動と逆転写の効率を制御するために、その発現がそのようなrp49（またRPLとして知られているような感染に変化しないと予想される基準ハウスキーピング遺伝子に対する標的遺伝子の記録された発現を標準化32）。 データを分析します。 <オール> 発現差の概算については、のように算出された各サンプルについて、参照遺伝子（ 例えば、rp49）から入手したSQ値に試験遺伝子（ 例えば、Diptericin A）相対（から得られた出発量（SQ）値の比を計算しますSQ – DPTA / SQ – rp49）。このような非感染ハンドリング制御などのベースライン対照治療にこれらの比率を拡大縮小。任意に1.0に等しい制御発現レベルを設定し、相対的な倍率変化などの実験治療を可視化します。既知量のcDNAの希釈系列から作成した標準曲線に対する各遺伝子のSQ値を推定します。 注：比率の統計的分析は、複雑になる場合がありますので、このアプローチは、厳密な分析のためのより迅速な近似のためのより良いです。 PCR効率が低い場合には、可能な場合はPCR反応速度を向上させるために、新しいプライマーを設計します。完璧に近い効率（広告付きqPCR反応のためのPCR産物のoublingサイクル毎）、閾値サイクル（C T）は SQ値に置換することができます。 最適に効率的な増幅を有する簡単な実験では、データは、ΔΔCT法を用いて分析することができる。19を各試料について、試験遺伝子のC T（ 例えば、Diptericinから参照遺伝子のC T値 （ 例えば、rp49）を差し引きますA）ΔCTを得ました。その後、各サンプルのΔΔCT値を生成する各実験サンプルについてΔCTからベースラインコントロールのΔCTを引きます。このΔΔCT 2（-ΔΔCT） は発現の倍数変化を近似する処理、との間の遺伝子発現レベルの相対的な差の指標です。 注：試験遺伝子または参照のいずれかのPCRの場合、標的遺伝子の発現におけるこの分析することができますひどく誤った評価倍率変化遺伝子は、効率が低いです。 最も厳密な分析のために、応答変数として試験遺伝子（ 例えばDiptericin A）の推定式や説明変数として制御遺伝子（ 例えば、rp49）と他の実験要因の推定式を用いて、分散分析（ANOVA）を行っています。 注：この方法は、PCR増幅中の非効率性に比較的強く、より複雑な実験計画の分析を可能にします。