Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım
Summary
Biz nöronların CA1-CA3 dizi koruyan bir in vitro katlanmamış hipokampus geliştirdik. Nüfuz mikro elektrot dizisi ile birlikte, sinir aktivitesi hem uzunlamasına hem de enine yönlerde izlenebilir. Tüm hipokampta yayılma aynı anda kaydedilebilir Bu yöntem hippocampal slice preparatlarda fazla avantajlar sağlamaktadır.
Abstract
Bu protokol, hipokampus sinir aktivitesi eşleştirmek için bir mikro-talaşlı dizi ile birlikte in vitro düz hipokampus hazırlanmasında yeni hazırlanması için bir yöntem tarif eder. enine hipokampal dilim hazırlık hipokampus elektrofizyoloji çalışma en yaygın doku hazırlıktır. Bir uzunlamasına hipokampal dilim de hipokampus uzunlamasına bağlantıları araştırmak amacıyla geliştirilmiştir. kalınlığı yeterli oksijen difüzyonu sağlar, çünkü dokunulmamış fare hipokampüs, in vitro olarak yapılabilir. Doku bazı eksik ya da katlanmış ya olduğundan Ancak, bu üç hazırlıkları nöral yayılımı doğrudan erişim vermeyin. katlanmamış sağlam hipokampus enine ve in vitro hipokampus sinyal yayılma tam ölçüde analiz dokuya doğrudan erişim için düz bir konfigürasyonda boyuna bağlantıları hem de sağlar. Etkili bir t nöral aktiviteyi izlemek içinO hücre tabakası, özel imal edilmiş mikro-elektrot dizisi (PMEA) nüfuz yaptı ve katlanmamış hipokampus başvurdu. Yüksekliği 200 mikron 64 elektrot ile PMEA derin fare hipokampus içinde nöral aktiviteyi kayıt olabilir. katlanmamış hipokampal hazırlanması ve PMEA benzersiz kombinasyonu gürültü oranı yüksek bir sinyal ile hipokampusun iki boyutlu CA1-CA3 bölgeleri hızı ve sinir aktivitesinin yayılma yönü incelemek için yeni bir in vitro araç sağlar.
Introduction
Nöral sinyallerin sinir iletimi veya ilerlemesini anlamak beyinde 1-3 normal fonksiyon ve patolojik durumlarda hem nöral iletişim mekanizmasının belirlenmesi için çok önemlidir. hipokamp bu bellek, ve mekansal izleme gibi pek çok beyin fonksiyonlarında önemli bir rol oynar ve önemli ölçüde davranışı, 1,6 etki, çeşitli patolojik değişikliklerinin olduğu için beyindeki en yaygın olarak araştırılmış yapılardan biridir. Hipokampus karmaşık bir organizasyon sergiler rağmen, yapısı farklı unsurları kolayca tespit ve dilim hazırlama 4-6 ulaşılabilir. Hipokampusun enine yönde nöral etkinlik kıvrımlarının (AD), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 ihtiva tri-sinaptik yolu ile yaymak için bilinmektedir. Bu sinaptik iletim ve aksonal iletim communicati için çok önemli bir rol oynadığı da düşünülmektedirBu enine devresinde 4,6 üzerinde. Ancak, sinir sinyalin yayılma enine ve boyuna yönlerde 4,6 hem de yer alır. Bu hipokampus tamamen yayılma 4 belirli bir yöne gözlem sınırlamak dilim hazırlıkları kullanılarak araştırılmıştır edilemez olduğunu ima eder. uzunlamasına dilim uzunlamasına eksen 5 boyunca aksonal yolları araştırmak için geliştirilmiştir. Araştırmacılar ağırlıklı enine ve boyuna eksenleri sırasıyla 6 boyunca davranış özel gama ve teta salınımlar gözlemledik. Bu davranışlar ayrı ayrı ele alınmıştır, ancak her iki yöne aynı anda erişim bu davranışları anlamak önemlidir. Hatta sağlam hipokampus hazırlık gelişimi ile, bunun nedeni hipokampus 4 katlanmış-yapısına tüm dokusu boyunca yayılmasını izlemek zordur. katlanmamış hipokampus dolu nöronlar erişim sağlardüz iki boyutlu hücre tabakası 7,8 formunda.
Dentat girus (DG), (Şekil 1) açılma olarak, hipokampus, enine ve uzunlamasına bağlantı hem CA3 ve CA1 her ikisini de içeren iki boyutlu bir tabaka halinde düzenlenmiş, piramidal hücre tabakası ile sağlam kaldığı bir dikdörtgen şekline sahip düzleştirilmiş bir şekli benimser Nöral yayılmasını araştırmak için kullanılabilecek nöral doku düz bir parça bırakarak (Şekil 2) 8. Sinir aktivitesi daha sonra münferit cam pipetler, mikroelektrot dizileri, uyarıcı elektrot ve aynı zamanda gerilim duyarlı boyalar (VSD), 3,7,8 ile izlenebilir. Buna ek olarak, transgenik farelerin genetik olarak kodlanmış gerilim göstergesi yayılım modelini 9 izlemek için kullanılabilir.
katlanmamış hipokampal ağ yapılandırması düz optik yöntem kayıt için değil, aynı zamanda bir mikroelektrot dizisi için uygundur. Mpiyasada mevcut dizilerin ost düz ya da düşük profilli elektrotlar ile imal edilir ve doku dilimleri ve kültürlü nöronlar 10-12 hem nöral aktiviteyi kaydedebilirsiniz. Nöronların soma dokuya daha derin bulunduğu çünkü sinyallerin sağlam bir dokudan elde edilir, ancak bir sinyal-gürültü oranı (SNR) azalır. Yüksek boy oranları ile mikroelektrod elektrot diziler SNR geliştirmek için gereklidir.
Bu amaçla, bir nüfuz mikroelektrot dizi (PMEA), laboratuarda geliştirilmiş ve katlanmamış hipokampus 7,13 bir 20 um çapında ve 200 mm yüksekliğinde 64 sivri sokulmasıyla direkt olarak dokunun araştırmak olanağı sağlar . Bu mikroelektrot dizisi gerilim duyarlı boya görüntüleme kıyasla daha yüksek SNR sahiptir ve SNR bir deney 7,13 sırasında sabit kalır. katlanmamış hipokampal hazırlanması ve PMEA'nın kombinasyonu yatırım için yeni bir yol sağlariki boyutlu düzlem üzerinde nöral yayılmasını Igate. Bu tekniği kullanarak deneyler zaten sinirsel aktivite bağımsız sinaptik veya elektrik sinaps 7 yaymak sayede hipokampus nöral sinyal yayılım mekanizmaları hakkında önemli sonuçlar vermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
hipokampus uzunlamasına ve enine eksen delici mikroelektrot dizisi ile birlikte korunur gelişeceğini hipokampus hazırlama, geliştirme, hipokampus 7 anatomi bağlantıları veya nöral yayılmasını araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Bu açılımı prosedür de yetişkin farelerde hipokampus incelemek için geçerlidir. Bu hazırlık Son çalışmalar 4-AP-kaynaklı epileptiform aktivite gelişeceğini hipokampus tüm alanı boyunca bir diyagonal dalga önünde (Şekil 6) <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. 神经科学. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
