Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz
Summary
Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente.
Abstract
Este protocolo describe un método para preparar un nuevo en preparación hipocampo plana vitro combinado con una matriz de micro-mecanizado para mapear la actividad neuronal en el hipocampo. La preparación de cortes de hipocampo transversal es la preparación del tejido más común para estudiar la electrofisiología hipocampo. Una rebanada del hipocampo longitudinal también se desarrolló con el fin de investigar las conexiones longitudinales en el hipocampo. El hipocampo del ratón intactas también se pueden mantener in vitro debido a su grosor permite la difusión adecuada de oxígeno. Sin embargo, estas tres preparaciones no proporcionan acceso directo a la propagación de los nervios ya que algunos de los tejidos es falta o doblada. El hipocampo intacto desplegada proporciona tanto transversal y conexiones longitudinales en una configuración plana para el acceso directo al tejido para analizar la extensión completa de propagación de la señal en el hipocampo in vitro. Con el fin de controlar con eficacia la actividad neuronal de tque la capa de células, una costumbre hizo penetrar matriz de micro-electrodo (PMEA) se fabricó y se aplica al hipocampo desplegada. El PMEA con 64 electrodos de 200 m de altura podría registrar la actividad neuronal en el interior de el hipocampo del ratón. La combinación única de una preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva herramienta in-vitro para estudiar la velocidad y la dirección de propagación de la actividad neuronal en las dos dimensiones regiones CA1-CA3 del hipocampo con una elevada relación señal a ruido.
Introduction
La comprensión de la conducción neural o la propagación de señales neuronales es crucial para la determinación del mecanismo de la comunicación neural tanto en la función normal y condiciones patológicas en el cerebro 1-3. El hipocampo es una de las estructuras más ampliamente estudiados en el cerebro, ya que juega papel fundamental en varias funciones cerebrales como la memoria, y el seguimiento espacial y participa en varios cambios patológicos que afectan drásticamente el comportamiento, así 1,6. Aunque, el hipocampo exhibe una organización compleja, los diferentes elementos de su estructura se pueden identificar y acceder en la preparación rebanada 4-6 fácilmente. En la dirección transversal del hipocampo, la actividad neural se conoce para propagar a través de la vía de tri-sináptica que comprenden el giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Se cree que la transmisión sináptica y la conducción axonal juegan un papel importante para communicatien este circuito transversal 4,6. Sin embargo, la propagación de la señal neural tiene lugar tanto en direcciones transversal y longitudinal 4,6. Esto implica que el hipocampo no puede ser completamente investigó mediante el uso de preparaciones rebanada que limitan la observación a una dirección de propagación particular 4. El corte longitudinal se desarrolló para investigar las vías axonales lo largo del eje longitudinal 5. Los investigadores han observado gamma y oscilaciones theta-conducta específica predominantemente a lo largo del ejes transversal y longitudinal respectivamente 6. Estos comportamientos se han estudiado por separado, pero el acceso simultáneo a las dos direcciones es crucial para entender estos comportamientos. Incluso con el desarrollo de la preparación hipocampo intacto, es difícil controlar la propagación a lo largo de todo el tejido debido a la estructura plegada de la hipocampo 4. El hipocampo desplegada proporciona acceso a las neuronas envasadosen una forma de un plano de dos dimensiones 7,8 capa de células.
Desplegando el giro dentado (DG) (Figura 1), el hipocampo adopta una forma aplanada con una configuración rectangular en la que tanto transversal y conexiones longitudinales permanecen intactos con la capa de células piramidales dispuestos en una lámina bidimensional que contiene tanto CA3 y CA1, dejando una pieza plana de tejido neural que se puede utilizar para investigar la propagación neural (Figura 2) 8. La actividad neuronal puede entonces ser monitoreado con pipetas de vidrio individuales, arrays de microelectrodos, electrodos de estimulación, así como colorantes sensibles al voltaje (VSD) 3,7,8. Además, el indicador de tensión codificado genéticamente de ratones transgénicos se puede utilizar para rastrear el patrón de propagación 9.
La configuración plana de la red del hipocampo desplegada es muy adecuado para la grabación método óptico sino también para una matriz de microelectrodos. Ma mayoría de las matrices disponibles en el mercado están fabricados con electrodos perfil plano o baja y puede registrar la actividad neuronal en los dos cortes de tejido y las neuronas cultivadas 10-12. Sin embargo, la relación señal-ruido (SNR) disminuye cuando las señales se obtienen de un tejido intacto desde el soma de las neuronas se encuentra más profunda en el tejido. Se requieren conjuntos de electrodos microelectrodos con altas relaciones de aspecto para mejorar la SNR.
Para este efecto, una matriz de microelectrodos penetrante (PMEA) se ha desarrollado en nuestro laboratorio, y proporciona la capacidad para sondar directamente en el tejido mediante la inserción de espigas 64 con un diámetro de 20 micras y 200 micras de altura en el hipocampo desplegadas 7,13 . Esta matriz de microelectrodos tiene mayor SNR en comparación con la formación de imágenes colorante sensible al voltaje y la SNR se mantiene estable durante un experimento 7,13. La combinación de la preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva manera de invertirIgate la propagación neural sobre un plano de dos dimensiones. Los experimentos utilizando esta técnica ya han dado resultados significativos sobre los mecanismos de propagación de la señal neuronal en el hipocampo mediante el cual la actividad neuronal puede propagarse independientemente de las sinapsis sinápticas o eléctricos 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
El desarrollo de la preparación hipocampo desplegada, donde los ejes longitudinales y transversales del hipocampo se conservan en combinación con una matriz de microelectrodos penetrante, proporciona una poderosa herramienta para investigar las conexiones anatomía o propagación neuronal en el hipocampo 7. Este procedimiento de despliegue es también aplicable para el estudio de hipocampo en ratones adultos. Estudios recientes con esta preparación mostraron que la actividad epileptiforme inducida-4-AP pod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
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