Summary

Нейронной активности распространения в разложенном гиппокампа подготовки с проникающим Micro-электрода массив

Published: March 27, 2015
doi:

Summary

Мы разработали развернутый гиппокамп в пробирке, которая сохраняет CA1-Ca3 массив нейронов. В сочетании с проникающим массива микро-электрода, нейронной активности можно наблюдать как в продольном, так и в поперечном направлениях. Этот способ обеспечивает преимущества по сравнению с гиппокампа препаратов срезов в распространение в целых гиппокампа могут быть записаны одновременно.

Abstract

Этот протокол описывает способ получения нового препарата в пробирке с плоским гиппокампа в сочетании с микро-механической обработке массива для отображения нейронной активности в гиппокампе. Поперечный срез гиппокампа препарат является получение наиболее распространенным ткани гиппокампа для изучения электрофизиологии. Продольная гиппокампа ломтик был разработан для того, чтобы исследовать продольных связей в гиппокампе. В интактных гиппокампа мыши также могут быть сохранены в пробирке, поскольку его толщина позволяет адекватную диффузию кислорода. Тем не менее, эти три препарата не обеспечивают прямой доступ к нейронной распространения, так как некоторые из ткани либо отсутствует, либо сложить. Развернутая нетронутыми гиппокамп обеспечивает как поперечные и продольные связи в плоской конфигурации для прямого доступа к ткани для анализа в полной мере распространения сигнала в гиппокампе в пробирке. Для того, чтобы эффективно контролировать нейронную активность от ТОн клеточный слой, выполненный на заказ проникающего массив микро-электрода (PMEA) был изготовлен и наносили на развернутом гиппокампа. PMEA с 64 электродами 200 мкм в высоту может записывать нейронной активности в глубине гиппокампа мыши. Уникальное сочетание развернутой гиппокампа подготовки и PMEA обеспечивает новый инструмент в пробирке для изучения скорость и направление распространения нейронной активности в двумерных CA1-CA3 регионах гиппокампа с высоким отношением сигнала к шуму.

Introduction

Понимание нервной проводимости или распространение нейронных сигналов имеет решающее значение для определения механизма нейронной связи как в нормальной функции и патологических состояний, в головном мозге 1-3. Гиппокамп является одним из наиболее широко изученных структур в головном мозге, так как он играет фундаментальную роль в различных функций мозга, таких как память и пространственное слежение и участвует в нескольких патологических изменений, которые существенно влияют поведение, а 1,6. Хотя, гиппокамп обладает сложной организацией, различные элементы его конструкции могут быть легко идентифицированы и доступны в подготовке среза 4-6. В поперечном направлении гиппокампе, нейронной активности, как известно, распространяются через три-синаптический пути, которые включают в зубчатой ​​извилине (ГД), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Считается, что синаптическая передача и аксонов проводимости играют важную роль для communicatiв этой поперечной схеме 4,6. Тем не менее, распространение сигнала нейронной происходит как в поперечном и продольном направлениях 4,6. Это означает, что гиппокамп не может быть полностью исследована с помощью препараты срезов, которые ограничивают наблюдение к определенному направлению распространения 4. Продольный срез был разработан, чтобы исследовать аксонов пути вдоль продольной оси 5. Исследователи наблюдали поведение конкретных гамма и тета-колебаний преимущественно вдоль поперечных и продольных осей соответственно 6. Такое поведение были изучены отдельно, но одновременный доступ к обоим направлениям имеет решающее значение для понимания такого поведения. Даже при развитии интактного препарата гиппокампа, трудно контролировать распространение на протяжении всего ткани за счет сложенного-структуры гиппокампа 4. Развернутая гиппокамп обеспечивает доступ к упакованных нейроновв виде плоской двумерной клеточного слоя 7,8.

По разворачивается зубчатой ​​извилине (DG) (рисунок 1), гиппокамп принимает уплощенную форму с прямоугольной конфигурации, в которой оба поперечных и продольных связей остаются нетронутыми с пирамидальной слоя клеток, расположенных в двумерной листа, содержащего как CA3 и CA1, оставляя плоскую часть нервной ткани, которые могут быть использованы для исследования нейронной распространение (рисунок 2) 8. Нейронной активности может контролироваться с отдельных стеклянных пипеток, микроэлектродов массивов, стимулирующих электродов, а также напряжения чувствительных красителей (VSD) 3,7,8. Кроме того, генетически кодируемых индикатор напряжения от трансгенных мышей могут быть использованы для отслеживания шаблон для размножения 9.

Плоская конфигурация разложенном гиппокампа сети хорошо подходит для оптической записи метода, но и для массива микроэлектродов. MOST из коммерчески доступных массивов изготавливаются с плоскими или низкопрофильных электродов и может записывать активность нейронов в обоих срезов тканей и культивируемых нейронов 10-12. Тем не менее, отношение сигнал-шум (ОСШ) уменьшается, когда сигналы получены из интактного ткани, так как сомы нейронов расположены глубже в ткани. Микроэлектродные электродов массивы с высокими пропорциями требуется, чтобы улучшить SNR.

С этой целью, проникая микроэлектрод массив (PMEA) была разработана в нашей лаборатории, а также предоставляет возможность непосредственно зонда в ткани, вставив 64 шипов с диаметром 20 мкм и высотой 200 мкм в развернутых гиппокампа 7,13 , Этот массив микроэлектродов имеет более высокий SNR по сравнению с изображениями чувствительной красителя напряжения и SNR остается стабильным во время эксперимента 7,13. Сочетание разложенном гиппокампа подготовки и PMEA обеспечивает новый способ инвестироватьIGATE нейронной распространении над двумерной плоскости. Эксперименты, использующие этот метод уже дали значительные результаты о механизмах распространения нервного сигнала в гиппокампе при этом нейронная активность может распространяться независимо от синаптических и электрических синапсов 7.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Animal экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в университете. CD1 мышей обоего пола в возрасте от P10 до P20 используются в данном исследовании. 1. Решения для хирургии и эксперименталь…

Representative Results

Данные, показанные на чертежах здесь были записаны в разложенном подготовки гиппокампа с 4-AP (100 мкМ), добавленного во ACSF инкубации ткани в записи камеры при комнатной температуре (25 ° C). Обычно деятельность начинается в течение 5 мин, но в некоторых гиппокампа ткани от старых животных это…

Discussion

Развитие разложенном подготовки гиппокампе, где продольные и поперечные оси гиппокампа сохраняются в комбинации с проникающим массива микроэлектродов, представляет собой мощный инструмент для исследования соединений анатомии или нервных распространение в гиппокампе 7. Это ра…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.

Materials

desiccator jar LABRECYCLERS Inc. 5410 Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. 
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus N/A N/A A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. 
Custom made tissue recovery chamber N/A N/A Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors Fisher Scientific S17336B                                            Medco Instruments No.:81995  This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors Fisher Scientific 12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320 This scissors is used to cut the skull of the mice. 
Miltex
Hysterectomy Forceps
Claflin Medical equipment CESS-722033-00001 This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula Cardinal Health This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. 
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula Cardinal Health this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush Lowe's tem #: 105657                  Model #: 90219 The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper N/A N/A This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor N/A N/A Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. 
Custom fabricated microelectrode array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
Custom made filter and amplifiers circuits for the array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
Data acquisition processor 3400a Microstar Laboratories N/A This is a complete data acquisition system with A/D converter.

References

  1. Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
  2. Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
  3. Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
  4. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  5. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. 神经科学. 31 (3), 571-591 (1989).
  6. Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
  7. Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  8. Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
  9. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
  10. Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
  11. Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
  12. Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
  13. Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
  14. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
  15. Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
  16. Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
  17. Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
check_url/cn/52601?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Zhang, M., Kibler, A. B., Gonzales-Reyes, L. E., Durand, D. M. Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array. J. Vis. Exp. (97), e52601, doi:10.3791/52601 (2015).

View Video