Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array
Summary
Abbiamo sviluppato un ippocampo spiegato in vitro che conserva CA1-CA3 array di neuroni. In combinazione con la matrice di micro-penetrante elettrodi, attività neurale può essere monitorato in entrambi gli orientamenti longitudinali e trasversali. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto fettine ippocampali come la propagazione in tutta nell'ippocampo possibile registrare contemporaneamente.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per preparare una nuova preparazione in vitro nell'ippocampo piatta combinata con una matrice di micro-lavorato per mappare l'attività neuronale nell'ippocampo. La trasversale preparato fetta ippocampo è la preparazione dei tessuti più comuni per studiare ippocampo elettrofisiologia. Una fetta longitudinale ippocampo è stato sviluppato anche per indagare le connessioni longitudinali nell'ippocampo. L'ippocampo intatti mouse possono anche essere mantenute in vitro perché il suo spessore consenta un'adeguata diffusione dell'ossigeno. Tuttavia, questi tre preparazioni non forniscono un accesso diretto alla propagazione neurale dal momento che alcuni dei tessuti è mancante o piegato. L'ippocampo intatta unfolded fornisce sia connessioni longitudinali in una configurazione piatta per l'accesso diretto al tessuto di analizzare la piena portata di propagazione del segnale nell'ippocampo in vitro e trasversale. Al fine di monitorare efficacemente l'attività neurale da tegli strato di cellule, un fatto del penetrante gamma di micro-elettrodi (PMEA) è stato fabbricato e applicato l'ippocampo spiegato. Il PMEA con 64 elettrodi di 200 micron di altezza potrebbe registrare l'attività neurale in profondità all'interno dell'ippocampo di topo. La combinazione unica di un preparato hippocampal dispiegata e PMEA fornisce un nuovo strumento in vitro per studiare la velocità e la direzione di propagazione dell'attività neurale nei bidimensionali regioni CA1-CA3 dell'ippocampo con un alto rapporto segnale-rumore.
Introduction
Informazioni conduzione neurale o propagazione dei segnali neurali è cruciale per determinare il meccanismo di comunicazione neurale sia nel normale funzionamento e condizioni patologiche nel cervello 1-3. L'ippocampo è una delle strutture più studiati nel cervello in quanto svolge ruolo fondamentale in molte funzioni cerebrali come la memoria, e il monitoraggio del territorio ed è coinvolto in diverse alterazioni patologiche che influenzano notevolmente il comportamento e 1,6. Sebbene, l'ippocampo presenta una struttura complessa, i vari elementi della struttura possono essere facilmente identificate ed accessibili nella preparazione fetta 4-6. Nella direzione trasversale dell'ippocampo, attività neurale è noto per propagare attraverso la via tri-sinaptica che compongono il giro dentato (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Si ritiene che la trasmissione sinaptica e conduzione assonale svolgono un ruolo importante per communicatiin questo circuito trasversale 4,6. Tuttavia, la propagazione del segnale neurale avviene sia trasversale e longitudinale 4,6. Questo implica che l'ippocampo non può essere completamente studiato utilizzando preparazioni fetta che limitano l'osservazione ad una particolare direzione di propagazione 4. La fetta longitudinale è stato sviluppato per studiare le vie assonale lungo l'asse longitudinale 5. I ricercatori hanno osservato gamma e theta oscillazioni specifici comportamenti prevalentemente lungo la trasversale e assi longitudinali rispettivamente 6. Questi comportamenti sono stati studiati separatamente, ma l'accesso simultaneo a due direzioni è cruciale per capire questi comportamenti. Anche con lo sviluppo della preparazione dell'ippocampo intatta, è difficile controllare la propagazione tutto il tessuto a causa della struttura ripiegata-dell'ippocampo 4. L'ippocampo spiegato fornisce l'accesso ai neuroni imballatoin una forma di un piano bidimensionale strato di cellule 7,8.
Con dispiegarsi giro dentato (DG) (Figura 1), l'ippocampo adotta una forma appiattita con una configurazione rettangolare, in cui entrambe le connessioni longitudinali e trasversali rimangono intatti con lo strato di cellule piramidali disposti in un foglio bidimensionale contenente sia CA3 e CA1, lasciando un pezzo di tessuto neurale che può essere usato per studiare la propagazione neurale (Figura 2) 8. L'attività neurale può essere monitorato con i singoli pipette di vetro, matrici di microelettrodi, elettrodi stimolanti, così come coloranti sensibili tensione (VSD) 3,7,8. Inoltre, geneticamente codificato indicatore di tensione da topi transgenici possono essere utilizzati per monitorare lo schema di propagazione 9.
La configurazione piatta della rete dell'ippocampo spiegato è adatto per la registrazione metodo ottico, ma anche per una matrice microelettrodo. Most degli array disponibili in commercio sono fabbricati con elettrodi profilo piatto o basso e in grado di registrare l'attività neurale in entrambe le fette di tessuto e colture di neuroni 10-12. Tuttavia, il rapporto segnale-rumore (SNR) diminuisce quando i segnali sono ottenuti da un tessuto intatto dal soma dei neuroni si trovano più in profondità nel tessuto. Schiere di elettrodi microelettrodi con elevati rapporti di aspetto sono necessari per migliorare il SNR.
A tal fine, una matrice microelettrodo penetrante (PMEA) è stato sviluppato nel nostro laboratorio, e fornisce la capacità di sondare direttamente nel tessuto inserendo 64 picchi con un diametro di 20 micron e 200 micron altezza nell'ippocampo unfolded 7,13 . Questa matrice microelettrodo ha una maggiore SNR rispetto sensibili di imaging colorante tensione e il SNR rimane stabile durante un esperimento 7,13. La combinazione della preparazione dell'ippocampo dispiegata e PMEA fornisce un nuovo modo di investireiGate propagazione neurale su un piano bidimensionale. Gli esperimenti con questa tecnica hanno già dato risultati significativi sui meccanismi di propagazione del segnale neurale nell'ippocampo cui attività neurale in grado di propagarsi autonomamente di sinapsi sinaptici o elettrici 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo della preparazione dell'ippocampo spiegato, dove gli assi longitudinali e trasversali dell'ippocampo sono conservati in combinazione con una matrice microelettrodo penetrante, fornisce un potente strumento per studiare le connessioni anatomia o propagazione neurale nell'ippocampo 7. Questa procedura dispiegarsi è applicabile per lo studio ippocampo in topi adulti anche. Recenti studi con questa preparazione hanno mostrato che l'attività epilettiforme 4-AP-indotta potrebbe propaga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
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