طبيعي والخبيثة زرع العضلات خلية إلى المناعي للخطر اسماك الزرد الكبار
Summary
Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.
Abstract
أصبحت الزرد أداة قوية لتقييم التنمية، وتجديد، والسرطان. وفي الآونة الأخيرة، تم وضع بروتوكولات زرع الخلايا المزروع أن engraftment تصريح من الخلايا الطبيعية والخبيثة إلى المشع، مسانج، والمناعي الزرد الكبار. هذه النماذج عندما يقترن مع بروتوكولات زرع الخلايا الأمثل السماح للتقييم السريع من وظيفة الخلايا الجذعية، وتجديد إصابة التالي، والسرطان. هنا، فإننا نقدم وسيلة لزرع الخلايا من الكبار الزرد العضلات والهيكل العظمي والعضلية المخططة الجنينية (ERMS)، وساركوما الأطفال التي تشترك الميزات مع العضلات الجنينية، إلى ضعف المناعة rag2 الكبار E450fs الزرد متحولة متماثل. الأهم من ذلك، هذه الحيوانات تفتقر خلايا T وقد خفضت وظيفة خلايا B، وتسهيل engraftment من مجموعة واسعة من الأنسجة من الحيوانات المانحة غير ذات صلة. بروتوكولات لدينا الأمثل تظهر أن fluorescently المسمى العضلات خلية preparations من الزرد المعدلة وراثيا α-الأكتين-طلب تقديم العروض تدبر بقوة عندما زرعها في عضلات ظهري من rag2 الأسماك متحولة متماثل. نحن أيضا إظهار engraftment من ERMS الفلورسنت المعدلة وراثيا حيث يقتصر مضان إلى خلايا بناء على حالة التمايز. على وجه التحديد، تم إنشاؤها في ERMS AB-سلالة myf5-GFP، mylpfa-mCherry الحيوانات والأورام المعدلة وراثيا مزدوجة حقن في الصفاق من الكبار المناعة الأسماك للخطر. فائدة هذه البروتوكولات تمتد إلى engraftment من مجموعة واسعة من الخلايا المانحة العادية والخبيثة التي يمكن زرعها في عضلات الظهرية أو الغشاء البريتوني من الزرد الكبار.
Introduction
الزرد ونموذجا ممتازا للدراسات التجدد لأنها يمكن تجديد الزعانف بتر، فضلا عن الدماغ التالفة، شبكية العين، والحبل الشوكي، القلب، والعضلات والهيكل العظمي والأنسجة الأخرى 1. الخلايا الجذعية والدراسات التجدد في الزرد الكبار وقد ركزت بشكل كبير على توصيف تجديد ردا على إصابة، في حين تحديد الجذعية والسلف الخلايا من الأنسجة المختلفة عن طريق زرع الخلايا مؤخرا فقط تم استكشاف 2. أصبحت الزرد أيضا تستخدم بشكل متزايد لدراسة السرطان من خلال توليد نماذج السرطان المعدلة وراثيا التي تحاكي الأمراض التي تصيب البشر 3 – 10.
في تحديد السرطان، أصبحت تبنى على نطاق واسع النهج زرع الخلايا وتسمح للتقييم فعالة من العمليات الهامة بما في ذلك السرطان التجديد الذاتي-11، عدم التجانس الوظيفي 12،13، 14 اتساع الأوعية الدموية، والانتشار،ردود العلاج 15، والغزو 16،17. ومع ذلك، غالبا ما يتم رفض الخلايا المغروسة من الأسماك المتلقي المقرر أن تستضيف الدفاعات المناعية التي تهاجم وتقتل الكسب غير المشروع 18. وقد استخدمت عدة طرق للتغلب على رفض الخلايا المغروسة. على سبيل المثال، والحيوانات المستفيدة جهاز المناعة يمكن أن يكون ذاب عابر بواسطة جرعة منخفضة غاما تشعيع قبل الزرع 18،19. ومع ذلك، فإن الجهاز المناعي المتلقي على التعافي من 20 يوما بعد التشعيع وتقتل الخلايا المانحة 18. بدلا من ذلك، تم استخدام العلاج ديكساميثازون لقمع T و B وظيفة الخلية، وتوفير تكييف القمعية يعد المناعة، وتسهيل engraftment من مجموعة واسعة من الأورام البشرية لمدة تصل إلى 30 يوما 14. هذه التجارب تتطلب ثابتة الجرعات المخدرات وتقتصر على دراسة الأورام الصلبة. وقد استخدمت المقايسات engraftment المدى الطويل خطوط مسانج وراثيا متطابقة 20-22، حيث المانحة وrecipiخلايا الأنف والحنجرة ليست محصنة ضد يقابل. ومع ذلك، تتطلب هذه النماذج خطوط المعدلة وراثيا التي تهم يمكن تجاوزه في الخلفية مسانج لأكثر من أربعة أجيال لإنتاج خطوط مسانج بالكامل. لتفادي قضايا الرفض المناعي في الأسماك المستفيدة، وقد وضعت مجموعتنا مؤخرا للخطر rag2 E450fs متحولة متماثل (ZFIN تسمية أليل rag2 fb101) خط التي خفضت T و B وظائف الخلايا والتي تسمح engraftment من مجموعة واسعة من الأنسجة إلى 23 في مأمن. وقد استخدمت ضعف المناعة نماذج مماثلة الماوس على نطاق واسع لزرع الخلايا من الماوس والأنسجة البشرية 24.
هنا، فإننا نقدم طرق لزرع العضلات الهيكلية والعضلية المخططة الجنينية (ERMS)، وساركوما الأطفال التي تشترك الميزات مع العضلات والهيكل العظمي، في rag2 وصف حديثا متماثل الزرد متحولة. إن وجود المناعي الزرد الكباريوسع قدرتنا على إجراء دراسات زرع الخلايا واسعة النطاق لتصور مباشرة وتقييم الخلايا الجذعية التجديد الذاتي داخل الأنسجة الطبيعية والخبيثة. مع هذا الأسلوب، fluorescently المسمى الاستعدادات الخلايا العضلية من الكبار α أكتين RFP-25 الزرد المعدلة وراثيا تدبر بقوة في rag2 الزرد متحولة متماثل بعد الحقن داخل العضلات الظهرية. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر engraftment وتوسيع -GFP myf5 الابتدائي؛ mylpfa- mCherry ERMS المعدلة وراثيا بعد الحقن داخل الصفاق إلى rag2 E450fs الزرد متحولة متماثل. فائدة هذه البروتوكولات تتجاوز الأمثلة الموضحة ويمكن تطبيقها بسهولة إلى الأنسجة التجدد الزرد إضافية والسرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد حققت engraftment فعال وقوي من البالغين الظهرية العضلات والهيكل العظمي مع طريقة إعداد الخلية بسيط جدا تليها حقن الخلايا في العضلات الظهرية من rag2 الأسماك متحولة متماثل. بشكل عام، كانت الإجراءات حقن في العضل قوية جدا، مع بعض الوفيات المرتبطة التالية مباشرة إجراء الزرع، تتراوح ما بين 10٪ إلى 35٪ اعتمادا على التجربة. سوف الأمثل الإضافي المحتمل تركز على استخدام الإبر قياس أصغر للحقن وتطوير جهاز حقن ثابتة باستخدام المجهر ومياداة مجهرية، مما يسهل سهولة زرع الخلايا. تستخدم نهجنا أيضا خلايا العضلات التي لم يتم فرزها من الحيوانات المانحة ويتضمن فقط ما يقرب من 30٪ الخلايا الاصلية العضلات. استخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا أن تسمية الخلايا الجذعية وFACS العزلة من المرجح تقديم تعليق خلية المخصب التي تؤدي إلى زيادة engraftment في الأسماك المستفيدة. العضلات والهيكل العظمي جells ويمكن أيضا أن أثرى ومثقف قبل الزرع، كما هو موضح سابقا (29). بشكل ملحوظ، نتائجنا تشير أيضا إلى أن خطوات إنشاء المتخصصة والتفريق بين الأنسجة العضلية المانحة تحدث قبل 10 آخر أيام زرع، وإنشاء هذا النموذج بمثابة منصة تجريبية قوية وسريعة لتقييم engraftment العضلات والتجدد. وعلاوة على ذلك، هذه التجارب يتباين بشكل صارخ مع تلك التي أنجزت في الفئران، حيث مطلوب قبل الإصابة من العضلات مع cardiotoxin أو الباريوم كلوريد يومين قبل engraftment 30،31. ومن المرجح أن إصابة إبرة تنتج أثناء إجراء زرع يقوي engraftment من خلال تحفيز إنتاج بيئة التجدد داخل الحيوان المتلقي 32،33. نحن نتصور أيضا أن أسلوبنا سيتم تكييفها بسهولة إلى زرع أنسجة العضلات والهيكل العظمي من الزرد الأصغر سنا، مما يتيح تقييم الطفرات الوراثية التي تؤثر على التنمية العضلات والهيكل العظمي في وقت مبكرولكن تؤدي إلى الفتك في مراحل اليرقات.
قدمنا أيضا على بروتوكول مفصل لengraftment من ERMS الزرد عن طريق الحقن داخل الصفاق إلى، rag2 الأسماك متحولة غير مكيفة متماثل. وكان هذا النهج مفيدا للتوسع من الأورام الأولية المعدلة وراثيا مزدوجة دون الحاجة لتوليد أورام داخل خط المعدلة وراثيا مسانج. وقد أظهرت عملنا مؤخرا أن النهج زرع الخلايا وتوفر نماذج تجريبية جديدة لتقييم حساسية العقاقير ERMS في الجسم الحي، حيث يمكن توسيع ورم واحد إلى الآلاف من الحيوانات وتقييم للآثار على النمو والتجديد الذاتي، واتساع الأوعية الدموية 15. وعلاوة على ذلك، قمنا المغروسة بنجاح مجموعة واسعة من الأورام في rag2 الأسماك متحولة متماثلة اللواقح بما في ذلك الخلايا T سرطان الدم الحاد الليمفاوي، سرطان الجلد، وERMS 23. تتطلع نحو المستقبل، ونحن نتصور أن هذه السطور أن تكون مفيدة لتقييم الخصائص الفنية الهامة للسرطان فيفيفو بما في ذلك تقييم عدم التجانس داخل ورمي، والغزو، ورم خبيث، الأوعية الدموية، ومقاومة العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن جيل من rag2 الأسماك متحولة متماثلة اللواقح في واضحة بصريا كاسبر سلالة الزرد 34 المرجح تسهيل التصوير المباشر للعديد من هذه السمات المميزة لمرض السرطان.
في المجموع، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لengraftment ناجحة من العضلات والهيكل العظمي fluorescently المسمى الطبيعي والخبيثة في البالغين لrag2 متماثل في مأمن متحولة للخطر الزرد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من عصير الليمون اليكس الوقوف مؤسسة (DML)، والجمعية الأمريكية للسرطان (DML)، وهوارد غودمان زمالة MGH (DML)، والولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة منح R24OD016761 و1R01CA154923 (DML). CNY التدفق الخلوي الأساسية وتحليل تدفق صورة، والأجهزة المشتركة رقم منحة 1S10RR023440-01A1. ويتم تمويل IMT من قبل الزمالة من مؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (فندجاو الفقرة على Ciência البريد TECNOLOGIA – FCT). ويتم تمويل QT من قبل مجلس المنح الدراسية الصين. نشكر أنجيلا Volorio لها تعليقات ونصائح مفيدة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | Transportation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | Transportation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | Transportation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | Transportation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | Transportation |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | Transportation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | Transportation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | Transportation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µL, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | Transportation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transportation. Any commercial solution can be used | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial solution can be used |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | Transportation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US) |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | Transportation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transportation. Any automatic pipetting controller can be used |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | Transportation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. 癌症研究. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -. J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. . Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -. J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a., Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
