Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em> Ex Vivo</em> Культура клеток

Кожа, в качестве основного интерфейса между телом и окружающей средой, обеспечивает первую линию защиты от внешних физических, химических и биологических оскорблений, таких как язву ультрафиолетового излучения и микроорганизмов. Кожа состоит из двух основных отделения, эпидермис и дерму, и содержит множество иммунных клеток , включая клетки Лангерганса, макрофаги, дендритные клетки (ДК) и около 20 миллиардов Т – клеток памяти, почти в два раза больше числа присутствующих во всем объеме крови ^{1 , 2.} Все больше данных поддерживает идею о том, что кожа имеет существенные иммунологические функции, как во время гомеостаза тканей и при различных патологических состояниях. Иммунные клетки резидентные в нормальной коже , как полагают, проводят иммунологического ³ и было показано, играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний , таких как псориаз ^4. В псориатической пораженной кожи, и CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т – клетки проникали были наблerved и показано , что отношение CD4 и CD8 варьирует в зависимости от состояния заболевания ^5. Тем не менее, эти популяции клеток трудно изучать, так как существующие методы позволяют изолировать только несколько клеток.

В настоящее время широко используются методы для выделения Т-клеток из человеческой кожи сочетают механическую диссоциацию кожи с ферментативной обработкой. Биопсий кожи человека широко фарша и инкубировали с ферментами , такими как трипсин, коллагеназа и / или ЭДТА ^6-8. Принимая во внимание , что кожа является барьером ткани , которая обладает высокой устойчивостью к растягивающих сил и механической дезагрегации, установленные методы выделения Т – клеток получают очень мало клеток, и даже более низкие количества жизнеспособных клеток, что делает ех Vivo культуры клеток этих клеточных популяций трудно и испытывающий.

Здесь мы сообщаем модифицированный метод для выделения лимфоцитов из обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем объединения Mechanскую диссоциация кожи с использованием автоматизированной диссоциатор ткани вместо установленного метода широко мясорубки вместе с ферментативное расщепление с помощью коллагеназы. Различные жизнеспособные подмножества иммунных клеток, включая контроллеры домена и Т-клетки наблюдались после приготовления одной клеточной суспензии. Важно, что экспрессия поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8 хорошо сохранился. Клетки , полученные таким способом, будут готовы к использованию в бывших клеточных культурах или естественных условиях анализа проточной цитометрии. Этот протокол был успешно применен для анализа единичных биоптатах кожи (4 мм), полученные из повреждений кожи у пациентов с псориазом. Результаты показали , что кожа пациента житель Т – клетки получают более провоспалительных цитокинов , таких как IL-17 и IFN & gamma ; по сравнению со здоровыми добровольцами ^9.