색채 금 나노 입자 분석에 적용 구조 전환 앱 타머를 선택하는 방법

1. 도서관 프라이머 설계 및 합성 초기 라이브러리와 프라이머 (이 항목은 이전의 출판물에서 광범위하게 검토되었다) (25), (26)을 디자인합니다. 표준 포스 포르 아미 다이 트 화학을 이용하여 본 연구를위한 다음의 서열을 합성 : 라이브러리 : GAATGGATCCACATCCATGG-N (40) -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA 앞으로 프라이머 : GGAATGGATCCACATCCATGG 역방향 프라이머 : 비오틴 AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA 라이브러리의 5'- 영역에 상보하는 cDNA로 캡쳐 프로브 디자인. 증가 된 용융 온도를 공급하는 각각의 후속 염기와 약간 RT 상기 용융 온도를 제공하는 온라인 융점 소프트웨어 분석에 의해 초기 길이를 선택한다. 메르 캡처 프로브 : CCATTCC – 비오틴 메르 캡처 프로브 : TCCATTCC – 비오틴 메르 캡처 프로브 : ATCCATTCC – 비오틴 표준 HPLC에 의해 라이브러리를 정화. 탈염 suffi입니다프라이머 및 캡처 프로브 효율적인. 업에 대한 몇 개월 -20 ° C에서 원하는 농도와 매장에서 뉴 클레아 무료 물에 올리고 뉴클레오티드를 복원합니다. 2. 버퍼, 라이브러리 및 샘플 준비 밀리 포아 또는 50 mM 트리스, 137 mM의 염화나트륨, 5 mM의의 MgCl 2, 산도 7.4의 농도 뉴 클레아없는 수준의 물에 버퍼의 500 ml의를 준비합니다. 멸균 된 0.2 ㎛ 멤브레인을 통해 버퍼 필터; 저장 달 동안 주변 조건에서 가능하다. 대안 적으로, 등을 PBS (인산 완충 생리 식염수), HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) 등의 다른 버퍼를 사용 두 thermomixers를 설정; 95 ° C에 1을 설정하고 주변 환경 (이 작품 ~ 20 ° C)에서 다른 보관하십시오. 얼음 양동이를 준비합니다. 열 / 100 μL 라이브러리를 배치하여 DNA 라이브러리를 냉각 스냅 (~ 10 15 -10 16 시퀀스 2.5 nmol의) 써모 설정5 분 t 95 ° C의. 자석 구슬이 (섹션 3.1-3.6)을 준비하는 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. λ = 260 nm에서의 UV 흡수에 의한 DNA 라이브러리의 실제 농도를 측정하고 적절한 라이브러리 변환율 적용. 대상 매체에 대한 용해도가 적절한 타겟 스톡 용액을 제조 하였다. DMSO 100 MM의 분석 주식을 준비합니다. 주위 조건에서 저장,하지만 서로 다른 목표는 다른 저하 프로필을 설명 할 것이다 때 이러한 주식은 약 1 개월 가능한입니다. 자석 구슬 및 선택의 초기 라운드 3. 준비 소용돌이 6.7 × 10 8 구슬 / ㎖ 스트렙 타비 딘 – 코팅 자석 구슬과 새로운 microcentrifuge 관 400 μl를 제거합니다. 2 분 동안 자석에 튜브를 삽입하고 상층 액을 제거합니다. 바인딩 버퍼, 와동 400 μl를 추가하고 배치 한 후 상층 액을 흡입하여 구슬을 씻으십시오자석에 튜브는 구슬을 분리합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. 50 μM (최종) 캡처 프로브 400 μL 바인딩 버퍼에있는 구슬을 재현 탁과 주변 조건에서 써모에 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 배양하여 자기 구슬 캡처 프로브를 고정. 무료 캡쳐 프로브를 제거하기 위해 3.2 절에 설명 된 세척 단계를 반복하여 비즈 바인딩 버퍼 400 μL로 3 회 세척 할 것. 결합 완충액 400 μL에 구슬을 재현 탁. 다음 단계는 비드 용액 100 μl를 제거하고 삼주의 최대 추가 선택 라운드에 사용할 4 ° C에서 나머지 300 μl를 유지합니다. 3.2 절에 설명 된대로 결합 완충액 200 μL로 두 번 구슬을 씻으십시오. 세척 구슬 2.3 절에서 스냅의 100 μL가 DNA를 냉각 추가하고 주위 조건에서 써모을 사용하여 부드러운 교반과 함께 30 분 동안 품어. NOTE : 제 라운드에서 DNA 농도는 고유 시퀀스 이론적 존재 이전 라운드에서 시퀀스의 손실을 최소화하기 위해 후속 발사 속도보다 더 높다. 섹션 2.3에서와 같이 UV 흡수를 이용하여 상등액 DNA 정량 및 비드에 결합 된 DNA의 양을 평가하기 위해 3.7 첨가 초기 량으로부터이를 빼기. 200 μL 주위 조건에서 5 분 동안 써모에 부드러운 교반과 함께 버퍼를 바인딩 두 개의 추가 세척 한 다음 바인딩 버퍼 200 μL와 구슬을 씻으십시오. 결합 완충액에 희석 된 100 μM 표적을 200 μL의 비드를 재현 탁하고, 주위 조건에서 30 분 동안 회전에 써모. 대상 및 제어가 시간이 지남에 따라 수용액 밖으로 집계 관찰 되었기 때문에 이전의 선택에 하루의 시작 부분에서 작업 솔루션은 신선한 준비합니다. 타겟 용출 서열을 함유 상등액을 보관추가 연구에 대한의. 섹션 3.8.1에서 제조 한 비드 μM 프로게스테론 200 μl를 첨가하여 1-2 발사 종료 후의 음성 선별을 수행한다. 주위 조건에서 써모에 30 분 동안 부드럽게 흔들. 구슬을 캡처하고 3.9 절에서와 같이 이전에 코티솔 추가로 결합 완충액 200 μL에 두 번 구슬을 세척, 상층 액을 제거하기 위해 자기 스탠드를 사용합니다. 4. 심화 모니터링, PCR, 및 단일 가닥 DNA 세대 선택 농축을 모니터링하는 투석 카세트 상등액을 추가한다. 투석 코티솔이 존재하기 때문에 DNA에 비해 훨씬 더 높은 농도에서 용출 된 DNA에서 코티솔을 제거 할 필요가 있고, 또한 표준 DNA UV λ 최대 = 260 nm의 중첩 UV 흡수 피크를 갖는다. 이 단계 선택의 초기 라운드에서 다른 모든 라운드 (라운드 2, 4, 6, 8)을 수행합니다. 이 샘플 로스를 완화의 각 시퀀스의 잠재적 몇 사본 번호가 존재 (최고 다양성) 때. 빠른 결과를 들어, 크기 배제 컬럼과 같은 대체 방법도 활용 될 수있다. 두번 주위 조건에서 2 시간 동안 결합​​ 완충액 250 ㎖ 중의 신선한 샘플을 투석 카세트. 버퍼를 교체하고 4 ° CO / N 품어. 대상이 용출 된 DNA의 비율을 결정하기 위해 UV 분광법에 의한 투석 풀을 분석 (섹션 3.8의 결과를 비교). / V에 티듐 브로마이드 w 1 %와 3 % 아가 로즈 젤을 준비한다. 본 연구에서는 아가로 오스 1.5 g, TAE 버퍼 (40 mM 트리스 아세테이트, 1 mM의 EDTA, pH가 8.0) 50 ㎖ 및 에티 디움 브로마이드 10 μL에서 겔을 준비합니다. ~ 5-15 사이클을 사용하여 작은 규모의 PCR (5 × 50 μL 씩)을 수행하여 투석 풀을주기-최적화 할 수 있습니다. PCR 성분의 경우, 1X PCR 반응 완충액 (모두 최종 농도), 200 μM의 dNTPs, DNA 템플릿의 10 % 반응 부피 500 nM의 각각의 프라이머, 2.5을 사용하여U 중합 효소 (2.5 U / μL 주식). 실행 PCR은 2 분 동안 95 ° C에서의 조건을 최적화 95 ° C (30 초), 55 ℃ (30 초)의 반복 사이클,이어서 72 ℃ (1 분) 후, 72 ° C (10 사용 하 분) 최종 확장을 4 ℃에서 개최. 비교를 위해 25 bp의 표준 사다리를 채택하고 젤 이미 저에 시각화. 원치 않는 부산물없이 올바른 크기 마커에서 가장 높은 강도의 밴드를 생산 사이클의 수를 선택합니다. 6X 블루 / 오렌지 로딩 염료 2㎕의 각 PCR 사이클의 10 μL를 결합하고, 단계 4.4 (45 분, 125 V)에서 제조 한 3 % 아가 로즈 겔 5 별도 웰에 로딩하여주기 최적화의 결과를 분석한다. 4.5 절에서 결정된 조건과 적절한 사이클 수를 이용하여 대규모 PCR을 수행합니다. 일반적으로 PCR 반응의 6-8 ml의이 선택의 각 라운드에 사용되는 1-2.5 nmol의를 얻기 위해 필요했다. 단순화하기 위해 8 스트립 튜브를 사용하여필요한 많은 튜브의 취급은 PCR 증폭이 볼륨을 나누어지는 수 있습니다. 4.4 절에 설명 된대로 3 % 아가 로스 젤을 준비하고, PCR 제품 밴드 섹션 4.5.2-4.5.3의 단계에 따라 정확한 위치에 표시되는지 확인합니다. 아래에서 설명하는 단계에 의해 단일 ​​가닥 DNA에 섹션 4.7에서 전체 이중 가닥 DNA 제품을 변환 : 프릿에 의해 차단 작은 열 스트렙 타비 딘 – 코팅 구슬 (자기되지 않음)의 300 μl를 추가합니다. 5 ml의 루어 잠금 주사기를 부착하고, 플런저에 부드러운 압력을 적용하여 버퍼를 바인딩 구슬을 씻으십시오. 열에서 주사기를 제거하고 구슬이 플런저 흡인에 의해 방해되지 않도록 각 물질의 첨가 후 주사기 오프라인에서 플런저를 제거합니다. PCR 제품을 추가하고 플런저에 부드러운 압력을 사용하여 열을 통해 전달합니다. PCR 제품의 더 이상 1-1.2보다 ㎖를 각각의 컬럼에 추가되도록 여러 열을 사용합니다. 최종 FL 폐기아우 통해 DNA 보낸 안티센스 가닥 비오틴 부위 것에 의하여 컬럼 상에 보유 될 것이다. 결합 완충액 5 mL로 열을 씻으십시오. 0.2 M의 NaOH 0.5ml를 첨가하여 DNA를 Dehybridize. 이 단일 가닥 센스 DNA가 들어 있으므로 용출액을 유지. 클레아없는 물로 세척하여 제조 탈염 컬럼에 0.5 ml에 첨가하여 0.2 M의 NaOH에서 ssDNA를을 탈염. 다음 1 ml의 뉴 클레아 무료 물을 추가하고이 탈염 ssDNA의 샘플을 수집, 초기 0.5 ml의 유체를 폐기하십시오. 복수 탈염 컬럼의 각 부에 대해, 0.5 ml를 요구한다. λ = 260 nm에서의 UV 흡수에 의해 용출 된 DNA의 농도를 결정. 진공 건조 샘플을 결합 완충액의 적절한 부피 재구성. 선택의 다음 라운드 얻어 충분한 DNA가 아니었다면, 섹션 4.6-4.9.2를 반복합니다. 선택 및 시퀀싱 5. 후속 라운드 농축 감시 (4.1)의 결과에 따라 선정 조건의 엄격함을 조정한다. 일반적으로, 풀에서 가장 높은 선호도 바인더를 선택하기 위해 연속적인 선택 라운드에서 조건이 더 엄격합니다. 주 :이 네거티브 선택 화합물의 농도, 또는 다른 방법 (27)의 다양한 증가 목표 농도를 감소, DNA 농도를 증가 세척 공정 수, 시간, 또는 볼륨 증가의 조합을 포함 할 수있다. 표적 분자에 대한 서열의 특이성을 보장하기 위해 적절한 적절한 컨트롤을 적용합니다. 본 연구에서는 시스템 (표 1) 3 라운드 시작과 선택을 통해 농도 증가에 부정적인 선택 분자 (프로게스테론)을 적용한다. 라운드 11 년부터 10 ~ 20 μm의 프로게스테론 이전 (3.7 이전) 비드에 고정화에 30 분 동안 DNA 풀을 미리 배양한다. </리> 최대 농축 관찰 후 포획 프로브의 길이를 증가시킨다. 호환 프라이머 및 고성능 폴리머와 PCR 증폭하여 염기 서열에 대한 최대로 농축 (라운드 13)과 최소 농축 (6 라운드) 상태를 나타내는 최종 풀 (라운드 15)과 다른 풀을 준비합니다. 1X (반응 완충액) 중 최종 농도를 사용하여 50 ㎕의 반응 부피로, 200 μM (각각의 dNTP), 400 nM의 (각 프라이머), DNA 풀 0.5 μL, 폴리머 및 0.5 μl를 설정한다. 사이클의 최종 연장 72 ℃에서 7 분 유지 제외한 동일한 PCR 조건을 사용하여 4.5 절에 설명 된 단계를 이용하여 각 라운드 최적화. 철저하게 비 접착 포장으로 밀봉 캡 마이크로 원심 튜브에 순서 시설로 제조 된 풀의 50 μl를 보냅니다. 버블 랩 및 선박 O / N 시퀀싱 시설에 얼음 팩과 함께 포장 15 ML 원뿔 튜브에 튜브를 놓습니다. </ol> 시퀀스 된 풀 (들)의 농축을 평가하기 위해 각 시퀀스의 카피 수를 결정합니다. 시퀀싱 시설에서 제공하는 모든 풀에 대한 데이터에 반복 된 각 시퀀스의 주파수 / 복사 번호를 결정하는 FASTA 형식으로 차세대 시퀀싱 데이터에 대한 단계를 (보충 코드 파일 참조) 정렬 / 코드 작성을 사용하여 가장 높은 카피 수 서열의 특이성과 친화력을 분석합니다. 상호 작용 (단백질 또는 작은 분자), 결합시 앱 타머의 구조적 특성, 예상 친 화성의 유형은 적합한 방법을 지시한다. 이 항목 참조 1,28-30의 숫자에 더 상세히 검토한다. 6. AuNP 합성 및 인식 시트르산 환원 방법을 사용하여 (21)을 합성 AuNPs. 끓는 2의 50 mM HAuCl 4 ㎖의 가열 밀리 포아 물 98 ㎖의 혼합. 로서 38.8 mM의 시트르산 나트륨 10 ㎖를 추가역류가 시작하자마자. 색상은 몇 분 후 붉은 색으로 변경됩니다. 열을 끄고 20 분 동안 용액을 교반을 계속합니다. AuNP 솔루션은 0.2 μm의 폴리 에스테르 막을 통과 한 후, 실온으로 냉각 필터링 할 수 있습니다. 어두운 호박색 병에 모든 AuNP 현탁액을 저장합니다. 2.4 × 10 8 L 몰 cm -1 -1 (31)의 흡광 계수를 이용하여, UV 흡수에 AuNP 농도를 계산한다. 농도는 동적 인 빛 (21) 산란에 의해 결정 17 ± 0.6 nm의 크기로,이 작품의 10 nm였다. 알루미늄 호일에 의해 보호 주위 조건에서 1 시간 동안 10nM의 AuNP와 DNA를 인큐베이션. AuNP의 부피가 원하는 모든 테스트가 수행 될 수 있도록하기에 충분한 해결책을 제공 따른 가변 (~ 1-2 mL)을 첨가 하였다. 73, 120, 200 및 D / NP (AuNP 당 DNA 분자)의 적재 밀도가이 연구에서 조사하고, 부피 및 농도는 그에 따라 변할 것이다. HEP를 사용하여 1 : DNA를 희석 / AuNP 액 (1)ES 완충액 (20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, pH는 7.4). 혼합물을 알루미늄 호일에 포함 RT에서 평형을 허용합니다. 주 :이 단계에 필요한 시간은 연구원에 의해 최적화 될 필요가있을 것이다. 본 연구에서는 몇 분에서 O에 이르기까지 시간은 / N을 조사 하였다. 분석 물 (코티졸, 콜산, 2- 메 톡시 나프탈렌) 100mm의 DMSO에 원액을 준비하고, 알루미늄 호일로 커버. 코티솔 결합 버퍼 (2.1)의 1/3 희석 100 μM에 주식의 희석하여 각 실험에 신선한 초기 솔루션은 이전에 확인합니다. 또한 1/3 결합 완충액으로 초기 용액을 희석되도록 타겟의 일정한 체적 (10 μL)의 농도 범위를 생성하기 위해 첨가된다. 1/3 결합 완충액 10 μL와 DNA / AuNP 용액 80 μl를 첨가하여 요구되는 염 농도를 최적화 ( "빈"이라한다). RT 후 염화나트륨 오디오 솔루션의 다른 볼륨을 추가로 20 분 동안 품어이온. 소금 또한 (이 작품에 사용 된 1 M NaCl을 13-40 μL) 후 푸른 색조를 향해 거의 시각적으로 눈에 띄는 변화를 유도하는 소금의 양을 찾습니다. 이것은 좋은 출발점을 제공하지만, 또한 대상을 포함한 결과를 다음의 추가 조정이 필요할 수있다. 대상 용액 10 μL와 DNA / AuNP 용액 80 μL를 결합 RT에서 20 분 동안 배양한다. 항상 빈 (6.8 절)을 포함하여, 동시에 여러 대상 농도를 분석하기 위해 96 웰 플레이트와 멀티 채널 피펫을 활용합니다. NaCl 용액의 적절한 용적을 (1 M NaCl을 13 μL가이 연구에서 적용되었다)를 첨가하고, 즉시 플레이트 리더를 사용하여 650 및 530 nm에서 흡광도를 분석한다. 블랭크 측정 대상에 대하여 정규화 농도 대 흡광도 값의 비 (650 E / E (530))와 같은 결과를 플롯.