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生物学

Une méthode de sélection aptamères Structure commutation Appliqué à un colorimétrique Or nanoparticules Assay

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52545
, , , , ,
1711th Human Performance Wing, Human Effectiveness Directorate, Air Force Research Laboratory,Wright-Patterson Air Force Base, 2The Henry M. Jackson Foundation, 3UES, Inc.

Summary

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Abstract

Les petites molécules constituent des cibles riches pour les applications de biocapteurs en raison de leurs implications physiologiques comme biomarqueurs de divers aspects de la santé et de la performance humaine. Aptamères d'acides nucléiques ont été de plus en plus appliqué comme éléments de reconnaissance sur les plates-formes de biocapteurs, mais la sélection des aptamères vers petites cibles moléculaires nécessite des considérations de conception spéciales. Cet ouvrage décrit la modification et étapes critiques d'une méthode conçue pour sélectionner des aptamères de structure de commutation à petites molécules cibles. Liaison des séquences provenant d'une banque d'ADN complémentaires hybridés à des sondes de capture d'ADN sur des billes magnétiques sont séparées du nonbinders l'intermédiaire d'un changement induit cible en conformation. Ce procédé est avantageux car les séquences de liaison de la matrice de support (billes) ne sont pas amplifiés, et il ne nécessite pas l'immobilisation de la molécule cible. Cependant, la température de fusion de la sonde de capture et la bibliothèque est maintenu à la température ambiante ou légèrement au-dessus, de telle sorte que les séquences de tdehybridize chapeau sur la base de la thermodynamique sera également présent dans la solution surnageante. Cette limite effectivement l'efficacité de partitionnement (capacité de cible séparée séquences de nonbinders liaison), et donc de nombreux tours de sélection sera nécessaire pour éliminer les séquences de fond. Le procédé décrit diffère de précédentes sélections aptamères la structure de commutation en raison de la mise en oeuvre d'étapes de sélection négative, suivi d'enrichissement simplifié, et l'extension de la longueur de la sonde de capture suivant enrichissement de sélection pour fournir stringence accrue. Les aptamères de la structure de commutation sélectionnés sont avantageux en une plate-forme de test de nanoparticules d'or qui signale la présence d'une molécule cible par le changement de conformation de l'aptamère. Le dosage de nanoparticules d'or a été appliqué, car il fournit une lecture colorimétrique simple et rapide ce qui est bénéfique dans un environnement clinique ou déployée. Conception et optimisation considérations sont présentés pour le test comme preuve-de-principltravaux de e dans un tampon de fournir une base pour une extension ultérieure de l'œuvre vers biocapteurs petite molécule dans les fluides physiologiques.

Introduction

Les petites molécules sont depuis longtemps reconnus comme jouant un rôle vital dans divers processus biologiques tels que la toxicité physiologique ou la nutrition, la signalisation cellulaire, et les traitements pharmaceutiques comme à la maladie 1. Plusieurs petites molécules ont également été proposés comme marqueurs biologiques indicatifs de conditions physiologiques, y compris le stress 2,3, la fatigue 4, 5 et la maladie. Par exemple, les niveaux de cortisol en corrélation avec le stress qui peut entraîner une diminution performance physiologique et d'autres conditions de santé 6-8. De même, des variations dans les rapports de certains peptides dans la salive sont prédictifs de la fatigue, où les manifestations physiologiques sont le manque de concentration, le temps de réaction altérée, et diminution de la fonction cognitive 4. Par conséquent, le développement de biocapteurs spécifiques à la cible à surveiller les niveaux de petites molécules peut fournir une métrique précieux pour évaluer les capacités de la santé et les performances d'un individual.

Historiquement, petite molécule de détection a été effectuée par des techniques de séparation ou de main-d'œuvre par l'anticorps reconnaissance basée 6,7. Plus récemment, des aptamères d'acides nucléiques 9,10 ont émergé comme éléments de reconnaissance qui possèdent des avantages distincts par rapport aux anticorps dans des applications spécifiques. Avec leur capacité à lier une cible variant en taille de 11 ions métalliques dans les tissus 12, aptamères ont été largement appliquées comme des éléments de reconnaissance dans les plates-formes de biodétection 13,14. Par rapport à des anticorps, des aptamères sont synthétisés chimiquement, et il est donc facile d'introduire des modifications chimiques reproductibles pour l'immobilisation de la surface ou de rapports. Les aptamères peuvent être choisis avec une grande spécificité cible dans les conditions souhaitées en modifiant les conditions de sélection utilisées, alors que les anticorps sont limités à des conditions physiologiques 15,16. En outre, les aptamères sont capables de densité de ligand plus élevé en raison de thEir petite taille, résultant en cible plus élevée de signalisation efficacité sur une plateforme de biocapteurs et de la stabilité accrue des aptamères permet une utilisation répétée et le stockage du capteur à long terme 16.

Les aptamères sont générées en utilisant un procédé connu sous le nom SELEX, dans lequel une banque initiale de séquences se dégage de 10 13 -10 15 molécules uniques pour un groupe final enrichi contenant plusieurs (10 1 -10 2) des séquences ayant le potentiel de se lier à la molécule cible. Le groupe final enrichi est ensuite séquencé, et les constantes de dissociation (K d) sont obtenues à partir des dosages plus élevés des séquences de nombres de copies de liaison avec la molécule cible. Evolution de la piscine à une population finale enrichie est suivie en surveillant le pourcentage de la liaison de la cible à chaque tour piscine, jusqu'à ce que l'enrichissement maximal est obtenu. Ceci a lieu sur un certain nombre de tours de l'évolution, où les séquences de liaison sont séparées de nonbinders et AMPLified en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR). La possibilité de partitionner efficacement et conserver liants est l'un des principaux déterminants de l'efficacité de sélection et un impact direct sur ​​les caractéristiques des aptamères sélectionnés 15. L'étape de partitionnement SELEX est plus difficile pour les petites molécules, car ils ne possèdent pas la taille ou de la variété de groupes fonctionnels qui aident le processus de partitionnement des cibles protéiques 1,15. Par exemple, de nombreuses plates-formes de protéines de partitionnement se appuient sur ​​la taille ou la séparation basée charge, mais les propriétés de complexes liés cibles molécules ADN-petit ne sont généralement pas très différente de celle des séquences non contraignants, ce qui entraîne une répartition inefficace. Des méthodes alternatives de partitionnement SELEX peuvent impliquer l'immobilisation ou l'étiquetage de la cible, qui modifient potentiellement les caractéristiques de liaison d'une petite molécule. Par conséquent, la conception d'une procédure de sélection pour générer des aptamères pour petite molécule cible récessite attention particulière.

Une variété de modifications ont été appliquées à la méthodologie SELEX original pour améliorer l'efficacité de séparation de la procédure, améliorer l'affinité ou la spécificité des séquences dans le pool finale, ou le rendre plus sensibles à différentes applications 15,16. Une modification SELEX capable de sélectionner de petites molécules a été conçu pour générer des aptamères de la structure de commutation, ou aptamères qui subissent un changement conformationnel lors de l'interaction avec la molécule cible 17,18. Dans un exemple de cette méthode, la banque est hybridée à un court segment d'ADN complémentaire non contraignante (ADNc) immobilisée sur des billes magnétiques 17. Lors de la liaison cible, le changement de conformation de séquences de liaison leur permettant de dehybridize partir de l'ADNc, de les libérer dans la solution surnageante, tandis que les nonbinders restant hybridés avec l'ADNc / billes sont magnétiquement partitionnés et jetés. Cette méthode est avangeuse pour les petites molécules car il ne nécessite pas l'immobilisation ou le marquage de la molécule cible pour obtenir la séparation.

Les aptamères qui sont capables de la structure de commutation possèdent une option utile pour ne importe quelle plate-forme de capteur biologique potentiel qui nécessite un changement de structure de l'aptamère à détecter la présence d'une molécule cible. En particulier, les aptamères peuvent être combinés avec des nanoparticules d'or (AuNPs) pour créer des essais qui fonction basée sur le principe de la structure de commutation pour produire une réponse colorimétrique en présence de la molécule cible après la provocation de sel 19,20. Dans un essai AUNP, l'aptamère ADN simple brin (ADNsb) adsorbe initialement à la surface AUNP et le protège de toute contestation de sel. La présence de la cible provoque un changement conformationnel dans l'aptamère qui expose la surface AUNP, entraînant un changement du rouge au bleu couleur après l'addition de sel. AUNP essais ont également été montré pour amplifier le signal, où affinité micromolaire aptamères peut détecter la cible à des niveaux ordres de grandeur inférieure à la constante de dissociation (K d) 21. Cette fonctionnalité est particulièrement intéressante pour les petites cibles moléculaires, où affinités vont généralement de faible micromolaire à des concentrations millimolaires 1,15. Généralement, le dosage est également rapide et relativement simple à réaliser, encourager une étude plus approfondie de tests aptamère-AUNP que les plateformes de détection de biocapteur.

Le but de ce travail est de fournir un protocole universel pour la sélection des aptamères de structure de commutation à de petites molécules pour des applications de biocapteurs utilisant le cortisol marqueur de stress comme une molécule représentant. Un système de détection de biocapteur AUNP est d'intérêt en raison de sa simplicité d'utilisation et la lecture colorimétrique, mais aptamères de structure de commutation sont applicables aux sorties de la plate-forme de détection alternatives, telles que électrochimique 22 ou de la fluorescence 23 qui fournissent également la détection par un changement dans aptamère conformation sur objectif contraignant. Par rapport aux méthodes précédentes, de multiples étapes de sélection négatifs ont été intégrées dans la conception 17,18, et un système de détection d'enrichissement base-UV simple a été mis en œuvre (Figure 1). Ce protocole est en contraste avec le schéma de détection d'enrichissement de radioligand utilisée dans des procédés 17 existants. La méthode proposée a également incorporé un accroissement de la longueur des sondes de capture d'ADNc utilisées pour la sélection d'accroître l'efficacité de la séparation et de régler efficacement la stringence de la sélection après enrichissement maximal a été observé 24. La stringence de plomb réglé à un pourcentage inférieur totale de l'ADN élue par la cible dans le pool final, mais conduit à des nombres de copies élevés d'une séquence qui se lient avec une affinité améliorée par rapport à la séquence de copie nombre le plus élevé d'une série antérieure. La copie de la séquence numéro le plus élevé du pool final a été appliqué à un dosage de AUNP à illustrer le fait que la séquence est justiciable d'une plate-formequi exige un changement structurel pour indiquer objectif contraignant. Ce test de tampon à base montre que la réponse du dosage AUNP peut être modifiée en changeant la densité de l'ADN appliqué à la surface, et sert de preuve-de-principe travaux de consacrer les efforts futurs de recherche vers le développement de petites molécules biocapteurs AUNP base aptamères-in les fluides physiologiques.

Protocol

1. Bibliothèque et Primer Conception et synthèse Concevoir la bibliothèque initiale et amorces (ce sujet a été examiné en détail dans les publications précédentes) 25,26. Synthétiser les séquences suivantes pour cette étude en utilisant la chimie de phosphoramidite: Bibliothèque: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA Forward Primer: GGAATGGATCCACATCCATGG Amorce inverse: biotine-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA Conception des sondes d'ADNc de capture pour être complémentaire à la région 5 'de la bibliothèque. Choisir la longueur initiale de l'analyse par logiciel de la température de fusion en ligne pour fournir une température de fusion légèrement supérieur à la température ambiante, avec chaque base subséquente fournissant une augmentation de la température de fusion. mer sonde de capture: CCATTCC-biotine mer sonde de capture: TCCATTCC-biotine mer sonde de capture: ATCCATTCC-biotine Purifier la bibliothèque par HPLC standard. Dessalage est sufficace pour les amorces et les sondes de capture. Reconstituer oligonucléotides dans l'eau sans nucléase à la concentration souhaitée et stocker à -20 ° C pendant plusieurs mois. 2. Tampon, bibliothèque, et la préparation d'échantillons Préparer 500 ml de tampon Millipore ou dans l'eau de qualité sans nuclease avec des concentrations de 50 mM de Tris, 137 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, pH 7,4. Filtrer le tampon à travers une membrane de 0,2 um stérile; stockage est possible dans les conditions ambiantes pendant des mois. On peut aussi utiliser d'autres tampons tels que le PBS (tampon phosphate salin), HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic), etc. Mettre en place deux thermomixers; mettre une à 95 ° C et de garder l'autre dans des conditions ambiantes (~ 20 ° C dans ce travail). Préparer un seau à glace. Heat / SNAP refroidir la banque d'ADN en plaçant bibliothèque 100 ul (~ 2,5 nmol de 10 15 -10 16 séquences) dans la thermomixer définir unt 95 ° C pendant 5 min. Placer le tube sur la glace tandis que les billes magnétiques sont préparés (sections 3.1 à 3.6). Déterminer la concentration réelle de la banque d'ADN par absorption UV à λ = 260 nm et en appliquant le facteur de conversion approprié pour la bibliothèque. Préparer les solutions de stock cibles dans un milieu approprié pour la solubilité cible. Préparer 100 actions d'analyte mM dans le DMSO. Ces stocks sont viables pendant environ un mois se il est entreposé dans des conditions ambiantes, mais des cibles différentes démontreront profils de dégradation différents. 3. Préparation de billes magnétiques et ronde initiale de sélection Vortex 6,7 x 10 8 / ml perles billes magnétiques revêtues de streptavidine et supprimer 400 pi à un nouveau tube. Placer le tube sur l'aimant pendant 2 minutes et retirer le surnageant. Laver les billes en ajoutant 400 pi de tampon de liaison, vortex, et aspirer le surnageant après avoir placéle tube sur l'aimant pour séparer les billes. Répétez ce processus trois fois. Immobiliser la sonde de capture sur billes magnétiques en remettant en suspension les billes dans un tampon de liaison avec 400 ul de 50 uM (final) sonde de capture et en incubant pendant 10 min sous agitation douce sur la thermomixer dans les conditions ambiantes. Laver les billes trois fois avec 400 pi de tampon de liaison en répétant les étapes de lavage décrits dans la section 3.2 pour éliminer la sonde de capture libre. Remettre en suspension les perles dans 400 pi de tampon de liaison. Retirer 100 pi de la solution de billes pour les prochaines étapes, et de conserver les 300 pi restants à 4 ° C à utiliser pour d'autres cycles de sélection pour un maximum de trois semaines. Laver les billes deux fois avec 200 pi de tampon de liaison comme décrit dans la section 3.2. Ajouter les 100 pi de pression refroidis ADN de la section 2.3 aux billes lavées et incuber pendant 30 min avec agitation douce en utilisant le thermomixer dans des conditions ambiantes. NOTE: Les concentrations d'ADN dans les premiers tours sont plus élevés que celui des tours suivants pour minimiser la perte de séquence dans les tours précédents où les séquences uniques sont théoriquement présente. Quantifier l'ADN dans le surnageant par absorption UV de l'article 2.3 et soustraire ce montant initial de la ajoutée à la section 3.7 pour évaluer la quantité d'ADN liée aux billes. Laver les billes avec 200 pi de tampon suivi de deux lavages supplémentaires avec 200 pi de tampon en agitant doucement la liaison sur une thermomixer pendant 5 minutes dans les conditions ambiantes contraignantes. Remettre en suspension les billes dans 200 pi de 100 pM de cible dilué dans du tampon de liaison, et la faire tourner sur Thermomixer pendant 30 minutes dans les conditions ambiantes. Préparer les solutions de travail frais au début de chaque jour, car avant la sélection de la cible et de contrôle ont été observées à se agréger dans la solution aqueuse avec le temps. Conserver la solution surnageante, qui contient la séquence cible éluées pour complément d'étude. Effectuer la sélection négative après l'achèvement de 1-2 tours par addition de 200 ul de 1 uM de progestérone pour les perles préparées à la section 3.8.1. Agiter doucement pendant 30 minutes sur de la thermomixer dans les conditions ambiantes. Utilisez le support magnétique pour capturer les billes et jeter le surnageant, on lave les billes deux fois dans 200 ul de tampon avant l'addition de cortisol liaison comme dans la section 3.9. 4. Suivi enrichissement, PCR, et Génération ADN simple brin Ajouter la solution surnageante à une cassette de dialyse pour surveiller enrichissement de sélection. La dialyse est nécessaire de retirer le cortisol à partir de l'ADN élue parce que le cortisol est présent dans des concentrations beaucoup plus élevées que l'ADN, et également a un pic d'absorption UV qui chevauche la norme λ max ADN UV = 260 nm. Effectuez cette étape toutes les autres manches (séries 2, 4, 6, et 8) dans les premiers tours de sélection. Cela atténue échantillon loss quand potentiellement quelques nombres de copies de chaque séquence sont présents (plus grande diversité). Pour des résultats plus rapides, d'autres méthodes telles que l'exclusion des colonnes de taille peuvent être utilisés aussi bien. Dialyser cassette avec échantillon frais 250 ml de tampon de liaison pendant 2 heures dans les conditions ambiantes deux fois. Remplacer tampon et incuber à 4 ° CO / N. Analyser la piscine dialyse par spectroscopie UV pour déterminer le pourcentage d'ADN élue par la cible (à comparer aux résultats de la section 3.8). Préparation d'un gel d'agarose à 3% avec 1% p / v de bromure d'éthidium. Dans ce travail, préparer un gel à partir de 1,5 g d'agarose, 50 ml de tampon TAE (40 mM de Tris acétate, 1 mM d'EDTA, pH = 8,0) et 10 ul de bromure d'éthidium. Cycle-optimiser la piscine dialyse en réalisant une petite échelle PCR (5 x 50 aliquotes) en utilisant ~ 5-15 cycles. Pour les composants de PCR, en utilisant un tampon de réaction PCR 1 x (toutes les concentrations finales), 200 uM de dNTP, le volume de réaction de 10% de matrice d'ADN, 500 nM de chaque amorce, et 2,5U polymérase (2,5 U / ul stock). Exécuter PCR en utilisant les conditions optimisées à 95 ° C pendant 2 min, suivi par des cycles répétés de 95 ° C (30 sec), 55 ° C (30 sec), et 72 ° C (1 min), puis une 72 ° C (10 min) extension finale et maintenir à 4 ° C. Employer une échelle standard de 25 pb pour la comparaison et de visualiser sur un imageur de gel. Sélectionnez le nombre de cycles qui produit la bande d'intensité plus élevée au niveau du marqueur de taille correcte, sans sous-produits indésirables. Analyser les résultats de l'optimisation du cycle en combinant 10 pl de chaque cycle de PCR avec 2 ul de 6x Bleu / Orange colorant de charge, et le chargement dans 5 des puits séparés du gel d'agarose à 3% préparé à l'étape 4.4 (125 V pendant 45 minutes). Effectuez une grande échelle PCR en utilisant les conditions et le nombre de cycle approprié déterminé à l'article 4.5. Typiquement 6-8 ml de réactions PCR ont été nécessaires pour obtenir le 1-2,5 nmol utilisé pour chaque tour dans cette sélection. Utiliser des tubes 8-bande pour simplifierla manipulation des nombreux tubes nécessaires pour aliquote ce volume pour l'amplification PCR. Préparer un gel agarose à 3% comme décrit dans la section 4.4, et de valider que la bande de produit de PCR apparaît à l'emplacement correct en suivant les étapes de sections 4.5.2-4.5.3. Convertir la totalité du produit d'ADN double brin de l'article 4.7 à l'ADN simple brin par les étapes décrites ci-dessous: Ajouter 300 ul de billes revêtues de streptavidine (non magnétique) à une petite colonne sont bloquées par des frittes. Laver les billes avec 5 ml de tampon de liaison en attachant une seringue luer-lock et en appliquant une légère pression sur le piston. Retirez la seringue de la colonne et retirer le piston de la seringue hors ligne après l'addition de chaque matériau de sorte que les perles ne sont pas dérangés par le plongeur aspiration. Ajouter le produit PCR et passer à travers la colonne en utilisant une légère pression sur le piston. Utilisez plusieurs colonnes de telle sorte que pas plus de 1 à 1,2 ml de produit de PCR est ajouté à chaque colonne. Jeter le fl finaleow travers depuis l'ADN sera retenu sur la colonne par le fragment de biotine sur le brin anti-sens. Laver la colonne avec 5 ml de tampon de liaison. Dehybridize l'ADN par addition de 0,5 ml de 0,2 M de NaOH. Conserver l'éluat car il contient l'ADN simple brin de sens. Dessaler l'ADNsb dans NaOH 0,2 M par addition de 0,5 ml de la colonne de dessalage préparé par un lavage avec de l'eau sans nucléase. Jeter la première 0,5 ml de liquide, puis ajouter l'eau libre 1 ml nucléase et de recueillir cet échantillon ssADN dessalée. L'utilisation de plusieurs colonnes de dessalage sera nécessaire pour chaque portion de 0,5 ml. Déterminer la concentration de l'ADN élue par absorption UV à λ = 260 nm. Vide sécher l'échantillon et reconstituer dans un volume approprié de tampon de liaison. Si il n'y avait pas suffisamment d'ADN obtenue pour la prochaine ronde de sélection, répéter sections 4.6-4.9.2. 5. rondes subséquentes de sélection et séquençage Ajuster la stringence des conditions de sélection en fonction des résultats de la surveillance d'enrichissement (section 4.1). En règle générale, rendre les conditions plus strictes dans les tours successifs de sélection afin de sélectionner le liant le plus élevé d'affinité de la piscine. NOTE: Il pourrait se agir d'une combinaison de l'augmentation de la concentration de l'ADN, ce qui augmente le nombre, l'heure, ou le volume des étapes de lavage, ce qui diminue la concentration cible, augmentant ainsi la concentration du composé de contre-sélection, ou une variété d'autres méthodes 27. Appliquer les contrôles appropriés, le cas échéant pour assurer la spécificité des séquences pour la molécule cible. Dans ce travail, appliquer une molécule de sélection négative (progestérone) au système (tableau 1) en commençant au tour 3 et l'augmentation de la concentration tout au long de la sélection. À partir de ronde 11, pré-incuber le pool d'ADN pendant 30 min avec 10-20 uM progestérone avant immobilisation sur les billes (avant la section 3.7). </li> Augmenter la longueur de la sonde de capture après enrichissement maximal est observé. Préparer la poule finale (ronde 15) et d'autres piscines représentant au maximum enrichi (ronde 13) et peu enrichis (rondes 6) les conditions de séquençage par amplification par PCR avec des amorces compatibles et une polymérase haute fidélité. Mettre en place un volume de 50 ul de réaction en utilisant des concentrations finales de 1 x (tampon de réaction), 200 pM de chaque dNTP (), 400 nm (de chaque amorce), 0,5 pi de pool d'ADN, et 0,5 ul de polymerase. Cycle optimiser pour chaque tour en utilisant les étapes décrites à la section 4.5 en utilisant les mêmes conditions de PCR à l'exception d'un 7 min attente à 72 ° C pour l'extension finale. Envoyer 50 pi des piscines préparés à une installation de séquençage dans des microtubes avec bouchons soigneusement scellés avec une pellicule non adhésive. Placer les tubes dans un tube de 15 ml conique emballé avec du papier bulle et le navire O / N avec des packs de glace à l'installation de séquençage. </ol> Déterminer le nombre de copies de chaque séquence d'évaluer l'enrichissement de la piscine (s) séquencé. Utilisez le code d'écriture / de tri étapes (Voir le fichier de code supplémentaire) pour les données de séquençage de nouvelle génération au format FASTA pour déterminer le nombre de fréquence / copie de chaque séquence répétée dans les données pour toutes les piscines fournis par l'installation de séquençage: Analyser la spécificité et l'affinité des séquences les plus hautes du nombre de copies. Le type d'interaction (protéine ou une petite molécule), les propriétés structurelles de l'aptamère lors de la liaison, et l'affinité prévu dictera la méthode qui convient. Ce sujet est examiné plus en détail dans un certain nombre de références 1,28-30. 6. AUNP Synthèse et détection Synthétiser les AuNPs en utilisant la méthode de réduction de 21 citrate. Mélanger 98 ml d'eau Millipore avec 2 ml de 50 mM de HAuCl 4 et porter à ébullition. Ajouter 10 ml de citrate de sodium 38,8 mM commeDès que le reflux commence. Couleur changera pour une couleur rouge après plusieurs minutes. Continuer de remuer la solution pendant 20 minutes avec le hors de chaleur. Laisser la solution refroidir à AUNP RT puis filtrer à travers une membrane de 0,2 um de polyester. Stockez toutes les suspensions AUNP dans une bouteille de couleur ambre foncé. Calculer la concentration AUNP par absorption UV, en utilisant le coefficient d'extinction de 2,4 x 10 8 mol L -1 cm -1 31. La concentration était de 10 nM dans ce travail, avec une taille de 17 ± 0,6 nm déterminé par diffusion de la lumière dynamique 21. Incuber l'ADN avec 10 nM AUNP pendant 1 heure dans les conditions ambiantes protégées par la feuille d'aluminium. Varier le volume de AUNP de fournir suffisamment de solution pour permettre à tous les tests souhaités à effectuer (~ 1-2 ml). Les densités de chargement de 73, (molécules d'ADN par AUNP) 120, et 200 D / NP ont été examinés dans ce travail, et le volume et les concentrations varient en conséquence. Diluer l'ADN / solution AUNP 1: 1 à l'aide HEPES tampon (HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH = 7,4). On laisse le mélange se équilibrer à la température ambiante couvert par une feuille d'aluminium. NOTE: Le temps nécessaire pour cette étape doit être optimisée par le chercheur. Dans ce travail, des temps allant de quelques minutes à O / N ont été étudiés. Préparer analyte (cortisol, l'acide cholique, 2-méthoxynaphtalène) des solutions d'achat d'actions à 100 mM dans du DMSO et couvrir de papier d'aluminium. Assurez solutions initiales fraîches avant chaque expérience par dilution du stock à 100 um à une dilution 1/3 du tampon de liaison de cortisol (section 2.1). Diluer la solution initiale avec le tampon de liaison tiers de sorte qu'un volume constant (10 ul) de la cible est ajoutée à générer une gamme de concentrations. Optimiser la concentration en sel nécessaire en ajoutant 80 ul de la solution d'ADN / AUNP avec 10 ul de tampon de liaison 3.1 (dénommée "vide"). Incuber pendant 20 min à température ambiante puis ajouter différents volumes de NaCl solution. Comparer le volume de sel qui induit un changement visuellement perceptible à peine vers une teinte bleu après addition de sel (de 13 à 40 pl de 1 M de NaCl utilisée dans ce travail). Cela fournit un bon point de départ, mais peut-être besoin de plus amples ajustement suivant les résultats, y compris plus de cible. Moissonneuse 80 ul de la solution d'ADN / AUNP avec 10 ul de la solution cible et incuber pendant 20 min à température ambiante. Utiliser une plaque à 96 puits et une pipette multicanaux pour analyser les concentrations cibles multiples simultanément, comprenant toujours une vierge (section 6.8). Ajouter le volume approprié de solution de NaCl (13 pl de 1 M de NaCl a été appliquée dans ce travail) et analyser immédiatement l'absorbance à 650 et 530 nm en utilisant un lecteur de plaque. Tracer les résultats que le rapport des valeurs d'absorbance (E 650 / E 530) en fonction de la concentration cible normalisée par rapport à la mesure à blanc.

Representative Results

La rigueur des conditions a été initialement maintenu bas de conserver liants présents dans faible nombre de copies dans les premiers tours. Le premier tour, en particulier, mis en œuvre la rigueur la plus basse pour préserver liants généralement présentés comme des séquences uniques, démontré par le cortisol élevé et les concentrations d'ADN, et le manque de mesures de sélection négative. Le succès de cette sélection d'aptamères est démontrée par l'évolution de la piscine à partir d'un faible pourcentage éluée par la cible (tour 2) à une fraction éluée ultérieure par la cible qui reste relativement constant lors des cycles de 12 à 13 (tableau 1). Ce plateau de l'ADN élue par la cible est traditionnellement un critère dans la sélection («enrichissement»). Cependant, ce procédé consiste en outre soulevé la stringence de la sélection après enrichissement en augmentant la longueur de la sonde d'ADNc de capture (figure 1). L'allongement de cette sonde augmente la force de l'hybridation entre le CDNA et la piscine, l'augmentation de la température de fusion (T m) du complexe, et nécessite une plus forte interaction entre la séquence cible et de libérer les séquences de liaison en solution. La première ronde de sélection mis en place une interaction d'ADNc plus faible en raison de une moins base G à l'extrémité 5 'de la bibliothèque. Ce est en accord avec les conditions de stringence généralement plus faible au premier tour, et ne devrait pas avoir un impact significatif le choix autre que de permettre liants potentiels ainsi que des séquences de fond (dehybridize basées sur la thermodynamique) pour passer à la prochaine ronde de sélection. Ces séquences de fond ont été minimisés que la sélection a continué vers l'enrichissement par la mise en œuvre plus élevés dans des conditions de stringence tours de sélection suivantes. Quand l'ADNc a été allongé à partir d'un 7-mère à un 8-mère au tour 14, le pourcentage d'ADN élue par la cible est réduite de 15,3% à 11,1%, pour un T m est passée de 19,2 ° C à 26,7 ° C. L'ADNc wtel que prorogé à 9-mer au premier tour 15 avec un T m de 31,3 ° C, laisser tomber le total élue à 3,3%. De plus amples informations sur l'enrichissement peut être obtenue par séquençage de plusieurs piscines, deux exemples enrichis et non enrichis-, afin de suivre la progression des piscines à chaque round. Séquençage de prochaine génération (NGS) a émergé comme une méthode puissante pour le séquençage dans la sélection, principalement parce que la séquence supérieur lit (nombre total de séquences rapporté) sont obtenus par rapport au séquençage Sanger. Ces séquences supérieur lit présente une plus grande couverture du nombre total de séquences dans la piscine, offrant une image plus complète de la diversité des séquences. NGS supprime également la polarisation de 32 clonage, séquençage et permet de plusieurs pools en un seul lot à l'ajout de codes à barres 24,33. NGS a été utilisé pour analyser la progression de l'enrichissement à partir de trois piscines séparées dans cette sélection de l'échantillon (figure 2). Piscinesdu tour 6 (léger enrichissement par rapport à tour 2% par élue), ronde 13 (le plus élevé d'enrichissement), et autour de 15 (le plus élevé de rigueur) ont été choisis comme points représentatifs de la sélection. Le nombre de copies de chaque séquence unique ont été tracées en tant que pourcentage du nombre total de lecture pour chaque séquence piscine. Le mieux classé (plus haut du nombre de copies) séquence ne constituait 0,1% de toutes les séquences dans la série 6 (33 435 au total, 22 463 séquences séquences uniques). Comme la piscine devient maximum enrichi au tour 13, les mieux classés séquence augmente de 15,4% comprennent de toute la piscine (17 681 séquences totales, 2987 séquences uniques), 150x plus élevé que dans la série 6, malgré seulement ~ augmentation 5x dans l'enrichissement observé par UV . Round 15 (28919 séquence totale lit, 2980 séquences uniques) a bondi à 44,9% de toutes les séquences représentées par la séquence de haut rang unique même si la surveillance de l'enrichissement de l'UV a montré que le montant élue par la cible était ~ 5x inférieur à celui du tour 13 ( Tableau 1 </strong>). L'enrichissement est également démontré par le faible pourcentage de séquences uniques (67% au premier tour de 6 à 10% au premier tour 15) que la piscine évolue de plusieurs à plusieurs séquences avec la liaison cible potentielle. En outre, la séquence Classé en première ronde 13 (15-3) était la troisième séquence la plus élevée du nombre de copies au tour 15 après la longueur d'ADNc a été étendu, et la séquence classé deuxième au premier tour 13 est devenu séquence de nombre de copies les plus élevés au tour 15 (15 -1): 15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT 15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT Des études antérieures ont examiné la liaison de ces deux séquences par thermophorèse microscopique et dialyse à l'équilibre 24. Les résultats ont montré cortisol significative contraignant pour la séquence 15-1 (K d = 6,9 ± 2,8 uM par dialyse à l'équilibre; 16.177; 0,6 uM par thermophorèse microscopique) tout en liaison minimale a été observée entre le cortisol et la séquence 15-3. Cela montre que l'augmentation de la longueur de la sonde de capture au tour 15 facilitée en fournissant des conditions de stringence élevées pour analyser le liant par affinité ultérieure. En outre, ni démontré observable séquence de liaison à la molécule de sélection négative, la progestérone, qui montre que l'addition des étapes de sélection négative a été bénéfique pour la procédure. Le fait que le liant d'affinité élevée est apparu suite à l'enrichissement maximale (déterminée par la méthode classique d'analyse du pourcentage de l'ADN élue par la cible) après des conditions de stringence élevées sont appliquées à des cycles supplémentaires de sélection valide la méthode de prolonger la durée de la capture d'ADNc sonder post-enrichissement. Ce résultat montre que du nombre de copies d'un pool séquencé et affinité pour la cible ne peuvent être associés sous certaines conditions 24,34, en concontraste avec un rapport avant impliquant une corrélation directe 35. Il souligne également le bénéfice de l'enrichissement de surveillance par NGS, plutôt que par la seule stratégie de% élue commune dans la plupart des sélections, qui peut varier naturellement d'un tour à l'autre que les conditions de stringence élevées sont appliquées. Cependant, élue% est utile pour l'enrichissement de surveillance lorsque des conditions similaires sont appliqués dans plusieurs séries. Par exemple, arrondit 6-10 conditions similaires toutes les parties concernées, sans changement significatif dans l'enrichissement (tableau 1). Lorsque ce est observée sur plusieurs tours, les conditions sont probablement trop strictes pour promouvoir l'enrichissement, et le chercheur devrait diminuer rigueur dans la prochaine ronde. Par exemple, la concentration de cortisol est passé de 35 pM à 100 pM dans les cycles 11 à 13, et le% éluée est passée de 2,5% en rondes 10 à 14,5% au tour 12. Par conséquent, éluée% peut servir de guide pour le réglage de la rigueur au cours d'une sélection lorsque símilar conditions sont comparées d'une ronde de négociations, et peuvent fournir des informations complémentaires à NGS pour déterminer un critère de sélection. Séquence 15-1 a été appliquée à un dosage AUNP pour déterminer si une séquence choisie de façon à produire un aptamère de la structure de commutation fonctionnerait dans un test qui repose sur un changement structurel de liaison suivant pour produire une réponse cible. Des études antérieures ont montré que initiales du dosage avec AUNP 15-1 répond à la contrainte biomarqueur cortisol, mais pas à deux autres marqueurs de stress, de l'épinéphrine et de la norépinéphrine, ou l'acide cholique, un marqueur de maladie du foie structurellement similaire au cortisol 24. La réponse a été observée dans la fourchette normale de cortisol libre rapporté dans le sérum humain (~ 150-600 nM) 6, la validation que l'aptamère sélectionné pour un changement structurel lors de la liaison cortisol produit une réponse dans le test AUNP. Dans ce travail actuel, la caractérisation du système a été prise un peu plus loin en ajustantla couverture (densité) de 15-1 sur la surface AUNP. En utilisant le même ensemble de conditions, la couverture de l'ADN a été porté de 73 D / NP (molécules d'ADN / AUNP), à 120 D / 200 D et NP / NP (figure 3). Acide cholique produit une réponse minimale, à l'exception de 10 uM à 200 D / NP. La réponse du dosage diminue à mesure que la couverture a été augmenté, tout comme les limites de détection (LOD). Le LOD était de 29,5 nM pour 73 D / NP, 145,2 nM pour 120 D / NP, et 27,3 pM pour 200 D / NP. Ce résultat est en accord avec les travaux de Smith et al. Qui a illustré que la réponse d'un essai AUNP utilisant l'aptamère de cocaïne a diminué lorsque la couverture de aptamère a été augmenté de 60 D / 300 D NP / NP 36. Cela implique que la gamme de détection de la cible d'intérêt peut être ajustée en fonction sur l'optimisation de la couverture de la surface de l'ADN dans le dosage AUNP. Cela pourrait être bénéfique lorsque l'on compare, par exemple, la gamme de Cortisol libre dans le sérum humain (~ 150 à 600 nM) par rapport à la salive humaine (~ 5-25 nM) <sup> 6,37. Bien que les fluides physiologiques sont beaucoup plus complexes que ce test de mémoire tampon, les résultats fournissent une extension sur le travail de preuve-de-principe démontrer que les conditions AUNP peuvent être ajustées en fonction de l'application, et que d'autres travaux en vue de l'élargissement de la moyenne à des liquides biologiques serait d'intérêt pour la communauté de biocapteur. Figure 1. Vue d'ensemble de la méthode de sélection structure de commutation. Une petite sonde ADNc de capture biotinylé est immobilisé sur des billes magnétiques revêtues de streptavidine. L'ADNc est complémentaire de la région 5 'de la bibliothèque, la bibliothèque se hybrider aux billes. Lorsque la cible est ajouté, un changement de conformation est induite pour libérer séquences de liaison de la perle, permettant partitionnement facilitée par l'application d'un aimant. Le surnageant est conservé pour surveiller l'enrichissement (ADN% élue par ee cible) par UV après dialyse la cible de l'ADN. Cette étape ne est nécessaire que si la molécule cible absorbe dans la même gamme UV comme l'ADN. Les séquences sont ensuite amplifiés par PCR et préparés pour la ronde de sélection suivants. Comme la sélection progresse, la sélection négative est appliquée, où les séquences éluées par la molécule de sélection négative sont éliminées, et les billes avec des liants cibles potentiels sont ensuite incubées avec la cible. La longueur de la sonde d'ADNc est augmentée suite à l'enrichissement maximale (% éluant) pour augmenter la stringence de la sélection. Ce chiffre a été réimprimé avec la permission de 24. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Tour [Cortisol] (M) [Progestérone] (uM) ADN lié (pmol) % Élue par cible ADNc Longueur 1 100 0 357,57 N / A 7-mer 2 50 0 145,49 1.4 7-mer 3 50 1 188,74 N / A 7-mer 4 50 5 336,4 2.3 7-mer 5 35 5 88,05 N / A 7-mer 6 35 10 303,89 3.1 7-mer 7 35 10 255,01 N / A 7-mer 8 35 10 236,81 <td> 2,1 7-mer 9 35 10 318,95 2.6 7-mer 10 35 10 297,18 2,5 7-mer 11 100 10 147,61 N / A 7-mer 12 100 10 154,36 14,5 7-mer 13 100 10 150,39 15,3 7-mer 14 75 20 247,71 11,1 8-mer 15 50 40 409,63 3.3 9-mer Tableau 1. progression de la sélection et de l'enrichissement par élution 24% < strong>. N / A (Non applicable) est signalé pour tours où la surveillance d'enrichissement dialyse / UV n'a pas été effectuée dans les premiers tours de sélection pour atténuer la perte de faible nombre de copies des séquences. Ce tableau a été réimprimé avec la permission de 24. Figure 2. Sélection enrichissement déterminée par séquençage de prochaine génération (A) de la série 6. (B) Round 13; (C) rondes 15. Les séquences ont été classés selon le nombre de copies. La séquence du nombre de copies plus élevé a augmenté de constituer un faible pourcentage de l'ensemble du pool séquencé au tour 6 (0,1%) à un pourcentage élevé au tour 15 (44,9%) que la piscine a été enrichie pour des séquences de liaison de cortisol. Ce chiffre a été réimprimé avec la permission de 24.et = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. AUNP réponse d'essai variant de 15-1 aptamère couverture. La densité de l'aptamère incubé avec la AuNPs a été porté de 73 D / NP (triangle rouge), de 120 J / NP (place vert) et 200 D / NP ( cercle bleu). réponses de cortisol sont des couleurs vives, la réponse acide cholique est dans des couleurs claires. La réponse du dosage est amélioré pour le cortisol à des densités plus faibles, réduisant ainsi le LOD et la gamme la cible peut être détecté dans. Les conditions avec la réponse de cortisol plus élevé (73 D / NP) ont été en outre caractérisés dans le domaine linéaire de fournir plus de points dans la fourchette normale prévue de cortisol libre rapporté dans le sérum humain (~ 150-500 nM) et la salive (5-25 nM ) 6,37. La réponse minimale de l'acide cholique appliquant les mêmes conditions 73 D / NP a êtreen détail dans les travaux antérieurs 24. Toutes les parcelles représentent la moyenne ± SEM pour les mesures double ou en triple. . Figure 4. Les résultats représentatifs de l'optimisation du cycle PCR de gauche à droite les puits représentent: quatre cycles, 6 cycles, 8 cycles, 10 cycles, 12 cycles, négative (pas de modèle d'ADN), 25 pb standard échelle d'ADN. Les conditions optimales sont observées à 8 cycles, où le groupe de produit unique est à haute intensité sans plus-produits présents à l'amplification des cycles supérieurs. Figure 5. AUNP dosage optimisation du temps d'incubation. Le temps d'incubation de l'étape AUNP / ADN de 73 à D / NP a été réduite de O / N (figure 3) à 30 min, et la cible incubation a été immédiatement suivie de l'addition de sel au lieu de 20 min après (figure 3). (A) La réponse est observée pour les diamants bleus (cortisol), mais pas pour l'acide cholique (cercles verts) ou 2MNP (2-méthoxy-naphtalène; carrés rouges). Toutes les parcelles représentent la moyenne ± SEM pour les mesures double ou en triple. (B) De gauche à droite: vide, 10 uM cortisol, 10 uM acide cholique, 10 uM 2MNP. Changement visuel peut être observé à l'œil nu pour le cortisol. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le fait que les petites molécules sont d'intérêt biologique, mais ne représentent que 19% de tous les aptamères signalés rend méthodes conçues pour la sélection des aptamères qui sont applicables à de petites molécules de grande importance. SELEX de petites molécules est particulièrement difficile car moins de groupes fonctionnels, les motifs structuraux, et la zone de surface sont disponibles pour interaction avec des séquences comparées aux protéines 1, et il a été estimé que moins de 30% des pièces pour toutes les cibles tentatives ont abouti à un aptamère 38. Par conséquent, il faut être conscient exceptionnellement de conception expérimentale et l'exécution en vue de sélectionner un aptamère avec succès à une petite molécule cible.

Procédé de sélection d'aptamères décrit dans ce travail est avantageuse car elle se applique à de petites molécules sans nécessiter de modification chimique qui peut altérer les propriétés de liaison. Il est également basé élution, ce qui signifie que, puisque til ADN, plutôt que de la cible, est d'abord lié puis éluée à partir des billes magnétiques par la cible, l'ADN d'interagir avec la matrice de talon ne est pas amplifié pour le prochain cycle de sélection en raison des liants à la molécule d'intérêt sont libérées dans le tampon de surnageant et des liants de matrice non spécifiques restent liés. A l'inverse, un procédé de contre-sélection contre la matrice est requise pour les méthodes qui immobilisent le cadre sur le support solide, car chaque tour ADN qui interagit avec la matrice sera amplifiée en plus des liants cibles 1. La méthode actuelle a été conçu comme un T m stratégie de sélection limitée. Cela signifie que la Tm de l'ADNc / piscine hybridation a été maintenue proche de la température ambiante. Morse a utilisé une stratégie similaire, mais appliqué une sonde d'ADNc 6-mère avec un T m <10 ° C avec des conditions de sélection à 4 ° C 17. Notre demande est pour un dosage de biodétection effectuée à la température ambiante, de sorte que la longueur de l'ADNc a été ajustée en fonctionLy. Cela permet de maintenir la stringence de la sélection suffisamment faible pour que des liants potentiels ne sont pas perdues en raison de l'interaction de liaison cible se produit dans un emplacement à distance qui ne est pas induit un changement de conformation capable de perturber la liaison de l'ADNc. Cependant, l'efficacité de séparation de la méthode proposée est faible parce que certaines séquences ci dehybridize uniquement sur la base de la thermodynamique. En revanche, Nutiu et al. Appliqué un ADNc 15-mer, et ne ont été en mesure d'identifier des aptamères pour deux des quatre objectifs, peut-être parce que la T m de la 15-mer était trop élevé pour permettre une libération par une petite cible molécule 18. Par conséquent, alors que la stratégie de sélection actuel, il faudra beaucoup de tours pour éliminer les séquences de fond, en contrôlant la rigueur de la sélection et de minimiser la perte de liants potentiels les chances de succès seront augmentés.

Beaucoup de nouveaux chercheurs à la sélection d'aptamères sont pas conscients des aspects importants liés à la PCR deliants potentiels. l'optimisation du cycle (section 4.5) est nécessaire parce que sur-amplification de banques d'ADN produit sous-produits indésirables (généralement de plus grande taille) au nombre élevé de cycles, et le produit désiré peut disparaître complètement avec un excès de seulement 5 cycles 39. Dans le cas de sur-amplification, les produits de PCR ne représentent plus les séquences élues par la cible, et les chances de succès de sélection sont considérablement diminuées. La figure 4 illustre un exemple de l'optimisation du cycle du tour 5 dans ce travail. Le cycle le plus faible produit une bande minimale de produit, la bande augmente dans le montant à 8 cycles; 10 cycles à la bande commence une transition à une plus grande taille sur-amplification produit, et est presque entièrement constitué du produit amplifié à l'intérieur de plus de 12 cycles. Un autre détail que de nombreux chercheurs inexpérimentés dans SELEX peut oublier, ce est que toute la piscine doit être amplifié dans l'amplification PCR à grande échelle (section 4.6) dans le sapiner tour pour atténuer la perte de liants. Le nombre de séquences uniques possibles d'oligonucléotides est de 4 N, où 4 représente les quatre bases d'acide nucléique, et N est le nombre de bases dans la région aléatoire de la bibliothèque. Pour ce travail, N = 40, ce qui entraîne dans un espace de séquences de 1,2 x 10 24 séquences uniques possibles. Le 2,5 nmol de bibliothèque utilisée dans le premier tour de sélection correspond à 10 ~ 15 molécules, ce qui signifie que chaque copie de l'ADN est probablement représenté dans le groupe initial comme une séquence unique. Par conséquent, la totalité du volume de l'ADN élue des billes par la cible doit être amplifié à conserver une copie de chaque liant potentiel de la prochaine ronde de sélection. Une fois cette amplification initiale a eu lieu, plusieurs copies sont disponibles pour la sélection dans les tours suivants où une solution homogène est supposé pour l'échantillonnage.

La concentration de la cible doit également être examiné attentivement à chaque tour. Nutiu et al. Utilisationconcentration d'une cible de da mM au long du processus de sélection, et un aptamère choisi ATP avec Kd = 600 pM 18. Tant le travail actuel et la recherche de Morse 17 ont commencé avec 100 uM cible, diminuant tout au long de la sélection, et ont abouti à des aptamères avec de faibles affinités micromolaires. Exactement ce qui autour de la rigueur devrait être augmenté (concentration cible inférieure) dépend du moment où l'enrichissement est observée. Une autre étape essentielle consiste à appliquer des mesures appropriées négatifs de sélection des aptamères ainsi démontrer la spécificité de la molécule cible. Quels contrôles sont utilisés, est subordonné à l'application prévue de l'aptamère sélectionné. Par exemple, 15-1 aptamère a été conçu pour fonctionner comme un élément de reconnaissance dans un essai de biocapteur pour le cortisol, la progestérone a été utilisé de sorte qu'une molécule de sélection négative parce que ce est un précurseur métabolique de cortisol qui se trouve dans les fluides physiologiques 40. L'aptamère ATP choisi par Nutiu et al. </ Em> ne comprend pas une étape de sélection négative, et interagit avec les molécules structurellement similaires, y compris ADP, AMP, l'adénosine, et dATP 18.

Une note finale pour examen est que le test AUNP nécessite souvent une optimisation considérable pour chaque paire aptamère / cible. Vous recherchez le volume de sel qui induit un changement peine visuellement perceptible vers une teinte bleue après addition de sel est un bon point de départ, mais le réglage du point de départ pourrait être nécessaire d'observer une réponse. Nous avons également trouvé que le test produit des réponses radicalement différentes en fonction de la concentration de tampon (le tampon de sélection peut nécessiter une dilution en raison de la concentration élevée en sel de tampons provoque souvent l'agrégation) et de la composition, le degré de couverture de l'ADN (figure 3), la préparation des échantillons (environ organique solvants utilisés pour dissoudre la cible peuvent provoquer un bruit de fond élevé que les masques ciblent réponse), la température, le type et la concentration de sel et incubatemps de tion (à la fois l'ADN et l'ADN avec AUNP / AUNP avec la cible). Dans des conditions optimisées complètement, les résultats sont généralement observés avec un temps d'incubation cible <5 min, ce qui démontre l'avantage d'une réponse rapide de la cible de la plate-forme de biodétection AUNP. Par exemple, sur la figure 5, le temps d'incubation de l'aptamère / AUNP étape a été réduite de O / N (figure 3) à 30 min, et le sel a été ajouté immédiatement (<10 secondes) après l'addition de la cible au lieu de 20 min plus tard (Figure 3 ) à une densité de charge de 73 N / NP. Cette augmentation de la réponse du Cortisol à ~ 82% de plus que l'ébauche (figure 5A) à une concentration de 10 pM de cible par rapport à environ 40% en utilisant les conditions précédentes (figure 3). Cette réponse peut être distingué à l'œil nu (figure 5B). Notez que la gamme linéaire de détection de cortisol est différente de celle utilisant les conditions précédentes, ce qui suggère que ces conditions peuvent être optimisées pour une désiréplage de détection. L'acide cholique et 2-méthoxynaphtalène (2MNP) contrôles ne produisent pas une réponse significative (figures 5A-B). Les chercheurs doivent être conscients que la réduction de ces temps d'incubation peut faciliter la réponse accrue des analytes avec la surface AUNP, qui peuvent contribuer à signal global amélioré (cible) ou de fond (des molécules non-cibles). Par conséquent, prudent AUNP conception et la performance dosage caractérisation est nécessaire pour chaque paire aptamère / cible.

Cette procédure décrit un protocole pour la sélection d'aptamères petites molécules de structure de commutation qui fonctionnent d'une plate-forme de biodétection tels que le dosage décrit AUNP, qui nécessitent un changement de conformation de l'ADN pour détecter la présence de la cible. Cependant, ce procédé pourrait être appliqué à d'autres systèmes de biocapteurs électrochimiques tels que la fluorescence ou qui fonctionnent sur le même principe pour pratiquement ne importe quelle taille de cible. La puissance du protocole peut être développé expérimentalement parplusieurs approches. Tout d'abord, la sélection elle-même peut être potentiellement améliorée en examinant méthodes d'optimisation tels que la détermination de la Tm idéale du / bibliothèque hybridation d'ADNc qui permet une interaction qui est suffisamment faible pour interagir avec une petite cible de la molécule, mais suffisamment solide pour réduire la quantité des séquences fond déshybridées uniquement de la thermodynamique. Cela condenser le nombre de cycles nécessaires pour la sélection, de gagner du temps en travail et à réduire la consommation de réactif. D'autres investigations sur des modifications à la sélection serait de déterminer les concentrations les plus favorables de perles et de l'ADN de telle sorte qu'une population diverse de séquences est exposé à la cible, en particulier dans la première série. Le succès de ces expériences de validation de principe de fournir une base à investir davantage de ressources à l'optimisation et l'adaptation du dosage tampon AUNP aux fluides physiologiques. Il ya un besoin légitime pour une plate-forme robuste rapide, biocapteur qui peut function comme un outil de diagnostic de l'état physiologique d'un individu, et le développement de l'essai AUNP dans le sérum humain, de la sueur, la salive ou se réunirait une cette lacune actuelle.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dynabeads M280 Streptavidin Invitrogen 112.06D Compatible with DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5113-01 This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation
Hydrocortisone Sigma H4001 ≥98%
Progesterone Sigma P0130 ≥99%
Cholic Acid Sigma C1129 ≥98%
NanoDrop ND-1000 NanoDrop ND-1000 Replaced by ND-2000 model
Tris Base Promega H5135 ≥99.9%
Sodium Chloride Sigma S9888 ≥99.5%
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98%
500 mL Filter System Corning 430769 0.22 µm cellulose acetate membrane
DNA Library Operon Custom HPLC purified
All other DNA IDT Custom Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC
Thermomixer  Eppendorf R Any model with  temperature and mixing speed control will work
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn Agilent 600674 Taq polymerase can be used as well
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade  Agilent 200415 Other brands will work here
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer Agilent 200532 This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase
GeneAmp PCR System Applied Biosystems 9700 Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work
Agarose-LE Ambion AM9040 ≥99.9%
Ethidium Bromide Sigma E-1510 Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style Glen Research 20-0021-01 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe
Replacement Filters Expedite Glen Research 20-0021-0F 1 µm size
Illustra NAP-25 Columns GE Healthcare 17-0852-01 Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette ThermoFisher Scientific 66205 2k MWCO used
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important
Sodium Citrate Dihydrate SAFC W302600 We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays
SpectraMax  Molecular Devices M5 Results were similar to Bio-TEK system
Synergy Bio-TEK HT Results were similar to Molecular Devices system
HEPES Buffer Amresco J848 Any brand that makes a sterilized product will work
250 mL Filter System Corning 430767 0.22 µm cellulose acetate membrane
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Other brands will work here
5 mL Syringe Becton-Dickinson 309646 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column
ThermoEC Minicell Primo ThermoFisher Scientific EC320 Compatible with Power Supply
Power Supply Fisher Scientific FB300 Compatible with ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418 Flammable liquid
2 Methoxynaphthalene Sigma 148245 99%
Assay Plate Corning 3370 96-well Flat Bottom, Sterile
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Martin, J. A., Smith, J. E., Warren, M., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay. J. Vis. Exp. (96), e52545, doi:10.3791/52545 (2015).
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