Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

Tüm hayvan çalışmaları İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından lisans altında kurumsal kurallarına uygun (proje lisans numarası PPL 60/1726 ve 60/4026) yapıldı. Not: Ev hayvanları 14 saat ışık UK yasal gerekliliklere ve 10 saat karanlık fotoperiyot uygun. Vahşi tip C57Bl6J fareler, yeşil floresan proteini (GFP), 8 ve nöronal hücreler 9 bir alt sarı floresan proteini (YFP) arada bir ifade ile Thy1 YFP farelerin her yerde ifade var Tau-GFP fareler kullanılarak hayvanlar üzerinde deney: hem transgenik çizgiler C57Bl6J arka plan üzerinde yetiştirilen bulundu. 1. Çalışma Koşulları ve Araçların hazırlanması Sterilizasyonu sağlamak için, bir laminar akış başlığı içinde tüm ortam hazırlama, doku diseksiyon ve kültür çalışmaları yapmak Bu ortam antibiyotik eklenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Her zaman medya / kültür plakaları / embriyo yemekleri gelmesini sağlayınızkullanımdan önce 37 ° C fırın içinde en az 1 saat, (diseksiyon ortamı / embriyo yemekleri) veya 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe (kültür ortamı ve plakalar) için. Bir saat için, sığır serumu albümini (BSA)% 0.1 çözeltisi içinde cam pipetler emmek ve sonra kurumaya bırakılır. Ince çekilmiş kavisli cam pipetler üretmek için, bunu gibi cam bükme, Bunsen alevinde pipetler çekin. Pipet çekilir sonra, bir cam kesici ile temiz bir kesim yapmak. Fırın yaklaşık 45 dakika boyunca 160 ° C'de sterilize edilir. NOT: Bu cam pipetler bir mağaza yumurtalıkların ve folikülleri aktarmak için gerekli olacaktır. Diseksiyon ve Kültür Medya 2. Hazırlık Diseksiyon Orta hazırlayın. Leibowitz L15 orta ve filtre, 3 mg / ml BSA, 0.2 mikron gözenek, 25 mm çapında bir filtre ile sterilize çözündürülür. Yenidoğan Yumurtalık Kültür. Neonatal yumurtalık kültür ortamı hazırlamak için EAC için ortamın 1 ml yapmakkültür edilecek h yumurtalık. 3 mg / α-Minimal Esansiyel Ortam ml BSA (αMEM) ve filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron gözenek, 13 mm çapında bir filtre ile sterilize çözündürülür. Neonatal yumurtalık kültür plakaları hazırlamak 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğa (her bir yumurtalık) içine yenidoğan yumurtalık kültür ortamının 1 ml ekleyin. Steril saatçilik forseps kullanılarak her bir oyuğa, parlak bir yüzey yukarı ortam üstüne bir polikarbonat membran yerleştirin. UV kullanmadan önce zarları sterilize. Folikül Kültürü. Folikül kültür ortamını hazırlamak için, 1 lU / ml rekombinant insan folikül stimüle edici hormon, 5 ug / ml askorbik asit ve% 5 h / h serumu ile ek α-Minimal Esansiyel Ortam yetişkin dişi farelerden elde edilmiştir. Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron gözenek, 13 mm çapında bir filtre ile sterilize edilir. Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.45 mikron gözenek, 25 mm çapında bir filtre içinden silikon yağı sterilize edin. Pla hazırlamaktes olmayan bir doku kültürü her oyuğuna folikül kültür ortamı 30 ul damlalar koyun (köklerinin her gün üzerindeki yeni satırlar halinde taşınmasını sağlamak için her bir levha yalnızca üst satır kullanılarak, 96 gözlü mikro-titre yuvarlak plaka muamele Kültür dönemi). Dikkatle orta buharlaşmasını önlemek için, sterilize silikon yağı 70 ul orta kaplaması. Folikül-over Co-kültür. Her folikül yumurtalık ko-kültür kurulmakta için orta 1 ml oluşturan, yukarıda adım 2.3.1 folikül kültürü gibi folikül yumurtalık ko-kültür için orta hazırlayın. , Plakalar hazırlamak için 24 oyuklu plakanın her oyuğuna orta 1 ml. Steril saatçilik forseps kullanılarak her bir oyuğa, parlak bir yüzey yukarı ortam üstüne bir Nucleopore membran yerleştirin. UV kullanmadan önce zarları sterilize. 3. Yenidoğan Over Diseksiyon ve Kültür Her steril cam embriyo çanak içine diseksiyon orta 1 ml yerleştirin. <li> İtlaf yenidoğan fare yavrular İngiltere Home Office yönetmeliklerine göre dekapitasyon itlaf, doğum sonrası gün 0 ile 5 yaş arası. İnce diseksiyon forseps bir çift kullanarak karın duvarı kaplayan cilt kavrayın ve cilt ve vücut duvarı büyük bir kesi yapmak. Tüm karın maruz böylece kesi çekerek açın. Mesane genellikle bu aşamada tıkanmış ve diseksiyon kolaylaştırmak için delinmiş olabilir. Saatçi forseps kullanarak dışına cesareti taşıyın. Her tarafta böbrek mesane up rahim boynuzları izleyin. yumurtalık rahim üstündeki sadece böbrek altında bulunan ve bir mikroskop altında bir bulut benzeri bir yapı olarak görünecektir. Saatçi forseps ile yavaşça yumurtalık kavrayın ve rahim olan eki koparmaya makas kullanın. Önceden ısıtılmış diseksiyon orta içeren embriyo yemekleri içine yumurtalıkların çifti aktarın. Isıtmalı sta bir diseksiyon mikroskop altında yumurtalıklar ince diseksiyon yürütmekge (37 ° C). Sadece yumurtalık kalana kadar, Bursal kesesi ve fallop tüpü dahil herhangi bir aşırı malzeme uzak trim için insülin iğneleri kullanın. (Şekil 1A bakınız) ince çekilmiş bir bombeli cam pipet, her bir zarın üstüne bir yumurtalık kullanılarak, yukarıda adım 2.2.2'de hazırlanan bir kültür plakasının her bir oyuğuna yumurtalık aktarın. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültürü. Ikinci günde ortamı değiştirin. Membran rahatsız etmemek için orta oyuk kenarında yer pipet: Önceden gazlanmış taze ortam için her bir ortamın% 50 alışverişi için bir pipet kullanın. 6 gün için kültürleri korumak. Kültür sonunda, orta dondurma ve düzeltmek veya gerektiği gibi, PBS kısa bir yıkamadan sonra yumurtalıklar dondurma. 90, histolojik analiz için dakika veya immünohistolojik analizi için 90 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde için Bouin fiksatifi olarak yumurtalıkların düzeltildi. Yapış doku yerleştirerek yumurtalıklar dondurmadaha sonra protein veya mRNA çıkarımı için -70 ° C'da dondurmadan önce, 5-10 dakika boyunca kuru buz tüp yerleştirerek bir polipropilen tüpü. 4. Folikül Diseksiyon ve Kültür 19-23 günlük dişi fareler itlaf ve yumurtalıklar izole. Herhangi bir kesi yapmadan önce% 70 etanol ile kürk ıslatın. Künt uçlu forseps kullanarak cilt sıkın ve cilt ve vücut duvarı hem nüfuz, diseksiyon makas ile karın büyük bir kesi yapmak. Diseksiyon araçları bir ince kümesi kullanılarak yolumdan gut taşıyın ve rahim bulun. Her tarafta böbrek altında bulunan yumurtalık rahim izleyin. Yavaşça saatçi forseps bir çift kullanarak yumurtalık açgözlü, ince diseksiyon makas ile rahim yumurtalıklar eki sever. Yumurtalık yağ yastığı çok toplama kaçının. Yumurtalıkların toplayın ve önceden ısıtılmış diseksiyon orta içeren bir embriyo yemekleri içine aktarın. TekrarSadece yumurtalık kalana kadar, Bursal kesesi ve fallop tüpü dahil herhangi bir aşırı malzeme uzak trim için insülin iğneleri kullanılarak yumurtalık bursa taşıyın. Kabaca insülin iğneleri kullanarak her yumurtalık yarıya. Dikkatle 1 ml diseksiyon ortamı içeren bireysel izle bardağa her yumurtalık yarısı transferi. Orta buharlaşmasını önlemek ve sterilite sağlamak için bir cam slayt her saat camı örtün. Mağaza izle gerektiği kadar 37 ° C fırında over yarılarını içeren gözlük, ancak en kısa sürede bir sonraki adımı diseksiyon yürütmek. Bir saatten fazla bu şekilde saklanan doku atın. Bir laminar akış başlığı içinde 37 ° C ısıtıldı mikroskop kademesine bir yumurtalık yarısı içeren transfer saat camı. Kabaca şöyle geç ön-antral folikül tespit etmek amacıyla, iki insülin iğneleri kullanılarak büyük parçalar halinde yumurtalık teşrih: Bu granüloza hücrelerinin 2-3 katmanları içeren ve çevresinde 180-200 mikron bir çapa sahip olacaktır. El ile herhangi bir i teşrihbir insülin iğne ve bir iğne tutucu teminat altına alınmıştır biri 30 x 0,25 mm akupunktur iğne kullanılarak dentified folikülleri. Çevredeki stroma çoğunu kaldırmak, ancak köklerinin bazal lamina zarar vermemek için dikkatli olun (Şekil 1B bakınız). Dikkatle önceden ısıtılmış diseksiyon orta içeren bir toplama saat camı içine disseke foliküllerini aktarmak için ince çekilmiş kavisli cam pipet kullanın. Folikülleri kaybetmemek için pipet ince kalibreli bölümünde folikülleri tutmak için dikkatli olun. Tedbir folikülleri doğru bir mikroskop takılan bir kalibre mercek ağı kullanarak. Onlar çapında 190 ± 10 mikron ölçmek yalnızca kültür için seçin folikülleri. Ayrıca kültür için tek sağlıklı, küresel folikülleri seçin; bu karanlık atretik alanlar olmadan, şeffaf olması, ve bazı bağlı teka dokusu ile birlikte, sağlam bir bazal lamina sahip olacaktır: Bu açıklamayı uymaz herhangi folikülleri atın. 1 arasında bir verimYumurtalık başına 0-15 folikül iyidir. Yukarıdaki adım 2.3.3 'de olduğu gibi yapılmış bir plaka oyuğuna tek folikül aktarmak için ince çekilmiş bir bombeli cam pipet kullanın. Dikkatle Kuyunun dibine (ve üst yağ bir katman içinde) içinde folikül yerleştirin. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültürü. En fazla 6 gün süreyle kültür köklerinin her gün iyi olarak ihtiva eden taze ortam içine köklerinin ediyor. Yukarıdaki adım 2.3.3 plaka hazırlanmasında olduğu gibi, 96 oyuklu bir plaka içerisinde sonraki satırı hazırlayın. Dengelenmesini sağlamak için, en az bir saat için inkübatör plaka dönün. Ince çekilmiş cam pipet kullanarak, orta taze kuyulara folikülleri aktarın. Kültür içinde herhangi bir noktada köklerinin taze ortam içine geçmeden önce iki gün boyunca bırakılması isteniyorsa, 60 ul (yerine 30 ul), folikül kültür ortamı damlacıklarının en az her bir folikül yerleştirin. , Folikül büyümesi üzerine veri toplamak, bir ey kullanarak, günlük folikülleri ölçmek içinepiece şebeke bir mikroskop monte. Yağ tabakası folikül çapı ölçümleri deforme, bu yüzden set-up için kalibrasyon katsayısı çalışacaktır. Kültür sonunda, orta dondurma ve düzeltmek veya yukarıdaki adım 3.10 gibi, sonraki analiz için doku dondurma. Folikül-folikül Co-kültür. Kültür iki folikülleri birlikte, köklerinin arasındaki etkileşimleri araştırmak için. Kültür yukarıdaki gibi, ama bir kuyuda, temas, iki folikülleri yan yana yerleştirin. Olmayan bir doku kültürü her oyuğuna folikül kültür ortamında 100 ul damlalar yerleştirin sterilize silikon yağı, 100 ul ortam kaplayan, 96-çukurlu mikro-titre düz-plaka işlemden geçirildi. Yukarıdaki adım 4.13 gibi taze kuyulara folikülleri aktarmak, ancak bunun yerine her gün ortamı% 50 değiştirmek için iyi bir jel ucu kullanmayın. Ko-kültür içerisinde doku kaynağını belirlemek için, ko-kültür, örneğin, o için farklı bir genetik kaynaktan elde edilen her foliküllerivahşi bir fare yumurtalık ve GFP yerde ifadesi ile bir fare yumurtalıktan diğerinden ne. GFP veya YFP doku kullanıyorsanız, kültür sırasında, mümkün olduğunca ışık doku maruziyeti en aza indirmek ve daha sonra sabitleme / işlem adımlarında. NOT: İki folikülleri tek, 'iki-folikül' birimine birlikte büyümek için normaldir (Şekil 1C bakınız). 5. Folikül-Yumurtalık Co-Kültürler Yukarıdaki Bölüm 3 ve 4 gibi yumurtalıklar ve folikülleri parçalara ayır. Yukarıdaki adım 2.4.2 'deki gibi hazırlanmış bir tabak içinde, bir zar üstüne bir yenidoğan yumurtalık yerleştirin. Dikkatle ince çekilmiş bir bombeli cam pipet kullanılarak neonatal yumurtalık bir kutup ile temas içinde tek bir folikül yerleştirin. En fazla 5 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültürü. Ko-kültür içindeki doku kaynaklı ayırt çok farklı iki yumurtalıklar ve köklerinin kullanmak içinurces, örneğin, bir vahşi tipli fare, biri de GFP yerde ifade ile, bir fare, bir için. Yukarıdaki adım 3.8 gibi günlük orta 500 ul değiştirin, ama folikül kültür ortamı kullanılarak. Ko-kültür esnasında folikül genellikle yumurtalık (Şekil 1D) ile kapatılmış hale gelir. Kültür sonunda, orta dondurma ve düzeltmek veya yukarıdaki adım 3.10 gibi, sonraki analiz için doku dondurma. 6. Sabitleme, İmmünositokimya ve Yetiştirme Doku Görüntüleme Kültür sonunda, PBS içinde doku yıkama ve 100 ul (folikül) ya da% 10 nötr tamponlu formalin için 1 ml (yumurtalık) transferi, ve buz üzerinde 1 saat süre ile sabitleyin. 4 ° C'de 1x PBS 3 yıkamadan geçmek. Folikülleri üzerinde kesitler imünosito kimya, her bir göze içermesi, yıkama ya da tedaviler ile, ince çekilmiş bir bombeli cam pipet kullanılarak bir 96-çukurlu mikro-titre yuvarlak delikli bir plakanın deliklerine aktarılır. Ovari ile kesitler imünosito kimyaes (veya yumurtalık folikülü ko-kültürler), vibrotome kullanılarak 50 um% 4 agaroz jel ve bölümde yerleştirmek. 24 gözlü bir levhanın gözleri içine Şamandıra bölümleri bir pipet ile çıkarılması, yıkama ya da muamele maddelerinin uygulanması için. Görüntüleme için: Düz cam slaytlar agaroz bölümleri aktarmak ve orta montaj monte; veya transfer folikülleri (veya folikül folikül kompleksleri) kavite cam slaytlar ve montaj orta olmayan sertleşme ile monte edin. Konfokal mikroskop kullanılarak görüntü örnekleri.