Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl
Summary
We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.
Abstract
The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB’s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.
Introduction
Granzymes היא משפחה של סרין פרוטאזות נמצאה בlysosomes ההפרשה של רוצח טבעי (NK) תאים ולימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTL) 1. חמש granzymes שונה קיימים בבני אדם (A, B, H, K ו- M), ועשרה בעכברים (- G, K, M ו- N) 2,3. Granzyme וGranzyme B (GzmA, GzmB) הם הנפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בהגדרה האנושית ומכרסמת.
הפונקציה הקלאסית של GzmB היא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי מטרת להורג בשיתוף עם perforin חלבון יוצרים הנקבובית, המאפשר לgranzyme לגשת cytosol תא המטרה 4. למרות שביטוי GzmB נמצא באופן חד משמעי בלימפוציטים מסוג רעיל לתאים, מחקרים שנעשו לאחרונה שטיפול במגוון של סוגי תאים להביע GzmB אחרים, לרבות אך לא רק לקרטינוציטים 5, בזופילים 6, 7 תאי פיטום, תאים דנדריטיים plasmacytoid 8, ותאי B 9, 10.בהקשר זה, פונקציות GzmB אינן אפופטוטיים נחשפו החל מההשתתפות בתהליכים דלקתיים, שיפוץ רקמות ומאפיינים אחרים immunoregulatory 11-14.
בהתחשב בכך שתפקיד ביולוגי רחב יותר הוצע לGzmB מאשר חשדו בעבר, חוקרים דורשים כלים אמינות וספציפיים לגילויה. יתרון הוא הדרישה הספציפית של GzmB לדבוק בצד carboxyl של שאריות חומצה אספרטית, נכס ייחודיים בין פרוטאזות סרין אוקריוטים 15. עכבר, אנושי וGzmB החולדה הם מבני דומים מאוד, עם זאת סגוליות המצע המורחב של GzmB העכבר שונה בעדינות מזה של שני בני האדם והעכברים 16, מה שאומר שמצעים מסוימים גנריות עם ASP במסוף (P1) ניתן ביקעו ביעילות על ידי GzmB מכל שלושת המינים, ואילו מצעים אחרים עם רצפים מורכבים יותר במעלה הזרם של P1 עשוי לתת תוצאות משתנים באופן נרחב. בעבר ובli האחרון יותרterature, עובדה זו גרמה לבלבול ופירוש לא נכון של המשמעות הביולוגית של כמה ממצאים ניסיוניים רבים, אף על פי שמבוקרת בקפידה, מחקרים הקינטית ביקשו לתקן את המצב 17.
במאמר זה אנו בקשנו להמחיש נקודות אלה באמצעות שני מצעים זמינים מסחרי, כלומר בוק-עלא-עלא-Asp-SBzl וN-אצטיל-איל-Asp-p-nitroanilide Glu-Pro. שני ריאגנטים לעשות ליצור קבוצות תגובתי שונות הבאות מחשוף (sulphydryl חופשי מול paranitroanilide חופשי ניאון), אבל אין לכך שום השפעה על מה שמחשוף פרוטאוליטים. הפרוטוקול המתואר הוא adaption מודרנית של פרוטוקול ישן מאוד 18, אבל צריך לעזור לחוקרים להשתמש במצעי GzmB השונים כראוי, גם בעת מתן מסגרת המתודולוגית לאיתור הפעילות של granzymes האחר, כגון GzmA וGzmH.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחינה הסטורית granzymes זוהו כמולקולות מפעיל עיקריות של לימפוציטים מסוג רעיל לתאים (תאי NK וCTL) מסוגל גרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה. זה היה בעיקר בגלל הפעולה של GzmB, שהבקיעה מולקולות מצע היעד בaspartate שאריות (ד ') ובכך הייתה מסוגל להפעיל את מפל caspase על ידי שני פרו-caspases ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Comment/description |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
- Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
- Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
- Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
- Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
- Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
- Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
- Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
- Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
- Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
- Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
- Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. 生物化学. 30 (8), 2217-2227 (1991).
- Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
- Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
- Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
- Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
- Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
- Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
- Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
- Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
- Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
- Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
- Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
- Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
- Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
- Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).
