Experimentele Glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van Magnetic microsferen

Ethische verklaring: Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), en in overeenkomst met het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken richtlijnen (goedgekeurd http://goo.gl/FLkirW , laatste toegang 10 juni , 2014) en de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , laatst geopend op 10 juni, 2014). 1. oculaire hypertensie Inductie Laten experimentele glaucoom door verhogen van de intraoculaire druk (IOP) via unilaterale injectie van paramagnetische microbolletjes in de voorste kamer van Brown Norway ratten, gebaseerd op de methode van Samsel et al. 3 andere gepigmenteerde ratten kunnen geschikt zijn, hoewel deze zouden moeten worden gevalideerd eerst door de gebruiker. Huis 250-300 g vrouwelijkeex-fokker Brown Norway ratten in een constante omgeving met weinig licht (40-60 lux) om dagelijkse schommelingen te minimaliseren in IOP 7, met toegang tot voedsel en water ad libitum. Neem basislijn IOP metingen in wakkere dieren 8 voor de anesthesie en bead injectie, met een rebound tonometer gekalibreerd voor gebruik bij de rat oog 9. IOP wordt genomen als het gemiddelde van vijf metingen. Verdoven ratten met 37,5 mg / kg ketamine en 0,25 mg / kg medetomidine hydrochloride intraperitoneaal afgeleverd. Bevestigen diepte van de anesthesie door het testen achterste voet reflexen dier, voorafgaand aan jodium applicatie (zie stap 1.5), en de kraal injectie povidon (zie stap 1.8). Dien 0,5% proparacaïne hydrochloride voor analgesie. OPMERKING: Laat de leerling niet in elk stadium verwijden. Dit zal helpen de kralen om beter te vestigen in de iridocorneale hoek, en het voorkomen van binding aan de lens. Toepassing oculaire zalf aan het hoornvlies drogen op-un bediende contralaterale ogen te voorkomen. WVerbrand het operatieve oog met 5% povidon jodium in het water 10 5 min voorafgaand aan de injectie. Na 5 min, lont de povidonjood uit met steriel gaasje en spoel de ogen met 0,9% steriele zoutoplossing. Houd het oog vochtig tijdens anesthesie met regelmatige toepassing van steriele zoutoplossing. Plaats een toroïdale magneet rond het oog. Injecteer 25 pi van een oplossing bevattende 30 mg / ml van gammastraling gesteriliseerd 8 urn magnetische microsferen in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in de voorste kamer, met een 33 G naald afgeschuind. Kralen bereiden wassen resuspenderen vervolgens centrifugeren 3 keer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten met 1 ml HBSS, alvorens de definitieve 30 mg / ml oplossing. Onderhouden steriele omstandigheden in. Voor injectie, wees voorzichtig om te voorkomen dat de naald om de iris, om het risico van iris trauma te minimaliseren. Dit kan worden voorkomen door richten van naald raakt aan het corneale oppervlak parallel aande iris mogelijk. Dit zal ook helpen om kraal verlies uit de injectieplaats te minimaliseren. OPMERKING: Spuit kralen in een snel tempo tot een gelijkmatige verdeling over de hele iridocorneale hoek, die cruciaal is voor het verhogen van IOP garanderen. Bovendien opslag kralen, naalden en magnetische ringen afzonderlijk zodat de korrels geen clusters, waardoor ze moeilijk te laden in de injectiespuit en injecteer en de naald niet gemagnetiseerd. Laat de naald in de plaats voor 1 min na de injectie om ervoor te zorgen dat de kralen vestigen in de iridocorneale hoek met waterige afvoer belemmeren van het trabeculaire netwerk. Iets hoek van de naald na de kralen zijn in eerste instantie geregeld om een ​​aantal lekken van water mogelijk te maken, om een ​​tijdelijke verhoging van de IOP te minimaliseren. Aan het einde van de operatie spoelen de naald door eerst met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), vervolgens 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water, om verder gebruik van de naald in afzonderlijke procedures. Als alternatief kan men gebruikwegwerp naalden als de juiste dikte en spuit combinatie is beschikbaar. Optioneel: naalden worden geslepen met een beveller gebruik ervan verlengen. In dit stadium, indien nodig, verwijder de magneet, en het gebruiken om kralen te trekken naar gebieden van onvolledige dekking. Laat de magneet op zijn plaats rond het oog voor een verdere 10 minuten na de injectie om ervoor te zorgen kralen vestigen ver in de iridocorneale hoek. Reverse anesthesie met 0,25 mg / kg atipemezole hydrochloride. Dien chlooramfenicol of andere antibiotische zalf, bijvoorbeeld gentamycine of terramycine topisch om infectie te voorkomen, en 0,5% proparacaïne hydrochloride analgesie. Verlaat dieren om te herstellen op een warmte mat, totdat zij weer beweging, vervolgens overbrengen naar een warme doos en voeding met extra voeding, zoals een voedingssupplement of bevochtigd normale dieet totdat herstel is voltooid. Systemische of lokale analgesie moet worden gegeven aan dieren met tekenen van pijn 24 uur na de operatie. Als these symptomen aanhouden, ondanks de behandeling, moeten de dieren op humane wijze worden gedood. Gebruik het contralaterale oog als geopereerde controle. Neem IOP metingen om de 2-3 dagen na toediening kraal en elke 2-3 dagen daarna met een rebound tonometer gekalibreerd voor gebruik bij de rat oog 9. De criteria om ogen studies zijn: indien 1) de IOP boven de contralaterale stuurdruk verhoogd door 5 mmHg, en 2) niet meer dan 60 mmHg. Ogen waar de druk terugkeert naar basislijn (gewoonlijk met 1 week na injectie) niet worden opgenomen in het onderzoek, maar het is mogelijk om opnieuw injecteren kralen in ogen die niet aan hoge IOP ontwikkelen indien gewenst. Euthanaseren dieren naar CO 2 stikken aan het einde van het experiment. Ontleden ogen en oogzenuwen en repareren in 4% paraformaldehyde (PFA) 's nachts voor verdere histologische analyse. 2. Het beoordelen van het netvlies Neuron Schade Met behulp van TUNEL Sbevattende Apoptotische cellen te kwantificeren in ganse berg retinasuse de terminal deoxynucleotidyl-transferase gemedieerde dUTP nick-labeling (TUNEL) assay, volgens de instructies van de fabrikant. Prepareer het netvlies van het oog beker, wassen 3 x 5 minuten in 0,3% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS-T). Permeabilize het weefsel in 3% T-PBS gedurende 2 uur. Pre-evenwicht netvlies in equilibratiebuffer gedurende 10 min vóór incubatie in TUNEL reactieoplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Was het weefsel voor 3 x 5 min in 0,3% T-PBS, spoelen in 0,3% T-PBS met 5 uM DAPI, en een flatscreen-mount in de montage media. Te kwantificeren TUNEL positieve kernen gebruik maken van een confocale microscoop tot 10 pm z-stacks door het ganglion cellaag nemen bij een vergroting van 20x. Neem 3 plaatjes op elk van de 4 blaadjes, op plaatsen dicht bij de optische zenuw, halverwege de periferie, en aan de andere rand van de retina, dus in totaal 12 afbeeldingen per geheel bert, bemonstering ongeveer 7.000 cellen. Morfologische criteria gediscrimineerd niet-neuronale (endotheel en gliale) cellen van neuronale cellen. Stalling voor beeldvorming met alleen de DAPI kanaal, en het masker onderzoekers behandelingsgroepen. 3. Het beoordelen van schade aan de oogzenuw behulp toluïdineblauw kleuring Fix oogzenuwen overnachting in oplossing Karnovsky's bij 4 ° C. Behandel specimens 2 uur in 1% (w / v) osmiumtetroxide en vervolgens drogen in 100% ethanol. Incubeer optische zenuwen in propyleenoxide gedurende 30 min, en plaats in een 50:50 mengsel van propyleenoxide: Araldite overnight. Verander deze oplossing tot 100% Araldite, gevolgd door incubatie overnacht bij 60 ° C. Cut semithin secties (0,75 mm dik) en de vlek met 1% toluïdineblauw / borax (TB) in 50% ethanol voor het onderzoek met lichtmicroscopie. 4. Statistische analyse Uit te voeren statistische analyseert behulp van een geschikte statistische softwarepakket. Een twee-weg ANOVA met Newman-Keul's post-hoc test kan worden gebruikt om statistische significantie berekenen IOP tijd verandert. Een p waarde van minder dan 0,05 kan significant worden beschouwd.