JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
环境科学

Технической точки зрения в современной годичных колец исследований - Как преодолеть Dendroecological и дерева Анатомические вызовы

Published: March 05, 2015
doi:
10.3791/52337
, , , , , , , , ,
1Landscape Dynamics / Dendroecology,Swiss Federal Research Institute WSL

Summary

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Abstract

Dendroecological исследования использует информацию, хранящуюся в кольцах деревьев, чтобы понять, как отдельные деревья и даже целые лесные экосистемы ответил на изменения окружающей среды и, наконец, восстановить такие изменения. Это делается с помощью анализа вариаций роста во времени и корреляции различных параметров по конкретным предприятиям, чтобы (к примеру) температурные рекорды. Интеграция дерева анатомические параметры в этих анализов будет способствовать укреплению реконструкции, вплоть до внутри ежегодной резолюции. Поэтому мы приводим протокол о том, как попробовать, подготовить и проанализировать деревянные образец для общих макроскопических анализа, но и для последующих микроскопических анализов. Кроме того, мы вводим потенциальное решение для анализа цифровых изображений, полученные от общих малых и больших образцов, чтобы поддержать анализ временных рядов. Протокол представлены основные шаги, в настоящее время они могут быть использованы. Помимо этого, есть постоянная потребность в усовершенствовании существующих методов и разработка новых тechniques, записывать и количественно прошлых и текущих экологических процессов. Традиционный деревянный анатомические исследования должна быть расширена, чтобы включить экологическую информацию в этой области исследований. Это будет поддерживать Дендропарк-ученых, которые намерены проанализировать новые параметры и разработать новые методики, чтобы понять краткосрочные и долгосрочные последствия конкретных экологических факторов на анатомии древесных растений.

Introduction

Деревья, а также кустарники, карликовые кустарники, и даже травы, показать многообразие моделей реагирования, связанные с изменениями в окружающей среде. Эти модели были предметом ботаники и физиологии растений, начиная с середины 19-го века. Тогда, исследования древесных растений сосредоточены в основном на деревьях и описательного анализа структуры и изменчивости годичных колец в экологическом контексте 1. Когда Андрей Элликотт Дуглас изобрел технику кросс-знакомств для годичных колец исследований 2, это экологическая контекст был более или менее подавлены новой способности точно датировать деревянные выводы в археологии. Кросс-знакомства впервые позволило точно датировать годичных колец на календарный год и является до сих пор считается в качестве основы годичных колец исследований во всех областях его применения 1.

Параллельно, начиная с конца 19-го века, дерево анатомия превратился в важный научно-исследовательской дисциплины относятсяd многих других областях естественных и прикладных наук 3. Два основных доменов устанавливаются: систематическое древесины анатомию, которая является основой для определения древесины в археологии 4, так и в прикладном древесины анатомию, связанных с лесной техники, физиологии, патологии и экологии 3,5.

В годичных колец исследований, дендроэкологии в настоящее время определяется как тему, охватывающий годичных колец, связанных исследований, посвященных экологическим исследованиям, такие как геоморфологических процессов (dendrogeomorphology), температуры и осадков реконструкций (дендроклиматологии), изменения уровня воды (dendrohydrology) или даже ледниковых колебаний ( dendroglaciology) 6. Как это определение указывает, анализ годичных колец становятся все более важными в области знакомства и реконструкции природоохранных процессов, таких как (I) последние климатических условиях на основе анализа годовых изменений в кольцевой ширина 7,8, древесины плотности 9 или изотопов 10, или (II) тон рецидивов интервалы геоморфологических процессов 11. Эти очень детальные исследования о кольцевых ширина вариаций и их изотопного состава свидетельствуют о необходимости проанализировать кольца более подробно, то есть, для изучения анатомического строения колец. Однако детальные исследования древесины анатомических особенностей в пределах годовых колец, связанных с экологическими изменениями редки 12,13. Хотя эти микроскопические особенности известны 14, они редко применяются на микроскопическом уровне в dendroecological исследований. Кроме того, точных сроков этих реакций роста в естественно выращенных деревьев, необходимых для точных целей знакомств, редко были задокументированы в последнее время 15.

Что касается последствий глобального потепления 16, совершенствование существующих и разработка новых методов для записи и количественно прошлых и текущих экологических процессов требуется, особенно в плане исследования воздействия климата 11.Расширяя традиционными деревянными анатомическое исследование в экологически древесных анатомии 17, дендропарк-ученые могут анализировать новые параметры и разработать новые методики, чтобы понять краткосрочные и долгосрочные последствия конкретных экологических факторов на анатомии древесных растений 18. Детальное знание о вариациях в различных параметров клеточных рамках отдельных колец, связанных с конкретными драйверами (например, механических сил, изменение климата) является основным требованием для понимания изменчивости в формировании годичных колец деревьев. По сравнению с общим кольцевым ширины измерений, определение дерева анатомические изменения требует более сложных и обширных методы подготовки, которые требуют много труда и времени. Подробные процедуры выборки резки, окрашивания и вложение многообразны и всегда зависит от цели исследования 19.

Для макроскопического анализа ширины кольца в хвойных или даже структур для количества, размера или помесщенияibution судов в лиственных пород, поверхность образца обычно полируют с помощью наждачной бумагой или специальные шлифовальные станки 20. Недостатком этой процедуры является заполнение отдельных клеток с пылью, которая предотвращает дальнейшее полуавтоматический микроскопический анализ 21. Наилучшие результаты для макроскопического пробоподготовки достигается при поверхности образца вырезают с помощью лезвия бритвы или другой острый нож.

В то время как для малых выборок, лезвия для них являются идеальным инструментом; большие образцы в качестве сердечников требуют резки плоских поверхностей на всем протяжении ядер. В отличие от шлифовки, клетки не заполнен пылью, которая позволяет дальнейшее препарат для последовательного анализа изображений. Кроме того, открытые просвета ячейки, надлежащим вырезанные стенки клеток, и плоской поверхностью всего образца позволяют применение высокочастотного денситометрии 22 на всю степени сердечника. Для изображения анализирует, поверхность образцов (мобильныйстены) могут быть окрашены с использованием темных чернил и просвет с открытыми порами затем могут быть заполнены с белым мелом, чтобы повысить контраст между клеточной стенки и области просвета 19,23. Это довольно простой метод позволяет основной макроскопический оценку крупных клеточных структур для измерения размера судна.

Эти методы для резки плоских поверхностей являются достаточными для макроскопических исследований. Для детального древесины анатомической (т.е. микроскопических) анализ, передается световая микроскопия является наиболее распространенным методом в дендро наук. Ксилемы клетки дифференцируются через сложные процессы, охватывающие определение типа клеток, деление клеток, дифференцировку клеток, и запрограммированной клеточной смерти 24. С сроках и скорости, с которой происходят эти процессы определяют клеток анатомические особенности, условия окружающей среды, влияющие на эти процессы могут генерировать анатомические отклонения в структуре кольца. В качестве важной предпосылки для их анализас, микро разделы должны быть готовы с микротоме 19. При подготовке проб для секционирования, видимость трахеиды или волокна направлении имеет решающее значение. Использование с ручным приводом скольжения микротомы рекомендуется сокращать микро секции, так как эта техника облегчает высококачественные разделы по мере необходимости для имиджа анализ 19. В зависимости от конкретной целью определенного исследования, микро участки разрезают перпендикулярно или параллельно продольной протяженности клеток. Эти разделы затем сфотографировали ниже микроскопом и размеры ячейки, измеренные с использованием специализированного анализ изображения программное обеспечение.

До недавнего времени, способность подготовить микро разделы не ограничивается малыми размерами выборки только (приблизительно 1 см х 1 см). Это приемлемо для анализа отдельные события, как нарушения в определенные годы, но этот метод не позволяет расширенный анализ временных рядов, необходимых для окружающей среды реконструкций. Эта работа может быть реализована толькоD за счет развития новых, эффективных и экономических процедур подготовки и аналитических методов. В последние годы, члены годичных колец лаборатории в Швейцарии WSL Федеральный научно-исследовательский институт в Швейцарии начали интенсивную работу по этой теме. В результате, новые устройства и методы анализирующие были разработаны, чтобы поддержать идею интеграции дерева анатомические особенности к широкому кругу вопросов, экологических изысканий.

Protocol

1. Методы отбора проб Для отбора керна, Для дерева выборки стебли, извлечь по крайней мере два ядра с помощью приращение бур друг от стволовых проанализировать свое развитие роста. Меняйте положение выборки от задачи исследования, например, для общего климата реконструкции принять ядер параллельно склону. При работе с тропическими видами, взять хотя бы три или более ядер. Используйте заточенный приращение бур (5, 10 или 12 мм в диаметре) и поместите бур перпендикулярно к растущему оси стержня. ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы иметь управляемый и стабильное положение дночерпателем, используйте толкатель, чтобы избежать движений дночерпателем кроме его вращения при бурении его в дерево. Диаметр цилиндра в ствол до упора в и через сердцевину. Для основной очень плотной древесины (т.е., тропические виды), использовать специальные реконфигурированного тела бензопилой с адаптером прироста ядер, которые позволяют ядра, даже густыми лесами, как Diospyrus ebenum (Ebony). </ Li> Используйте экстрактор и снимите результате ядро ​​из дерева. Выверните бур и удалить его из ствола. Добавить конкретный идентификатор извлеченного сердечника с помощью мягкой карандаш путем записи на ленту, который затем помещают непосредственно на сердцевине. Повторите процедуру на противоположной стороне ствола. Храните двух образцов дерева в пластиковых или бумажных гильз или специальные ящики для предотвращения повреждения. ПРИМЕЧАНИЕ: Бумага соломки полезны, особенно в тропических условиях, поскольку они предотвращают основные из литья. Наконец, установите ядер (направление волокон вертикально) на деревянных балках поддержки. Используйте холодную воду устойчивы столярного клея и дайте им высохнуть. ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не устанавливайте ядер на деревянных опорах, если цель исследования состоит дальнейшей химической, изотоп или анализ плотности. Для этих целей, исправить ядер в открытых кабельных каналов или одного гофрированный борту. Micro-каротаж Используйте специальный устройство перфорацииили иглы с отверстием 2 мм. В зависимости от толщины коры используют долото, чтобы удалить необходимую часть коры. Поместите устройство перпендикулярно оси растущего на стволе, как описано выше, и использовать молоток, чтобы проникнуть в ксилеме ствола до 2 см в глубину. Поверните иглу сломать результате микро ядро ​​внутри инструмента и удалить его из ствола. Храните микро ядер в микроцентрифужные флаконы и их пометить. Отбор проб диска В особых случаях (и особенно в тропиках), например, при отборе проб пни и поваленные деревья или всякий раз, когда это возможно, принимать дисков (сечения, перпендикулярные к растущей оси) с цепной пилой. Просто маркировать диски и не хранить их до дальнейшего анализа. ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура отбора проб чаще всего используется для всех сухих мертвых, исторические, археологические и суб-ископаемого материала, а также очень плотных лиственных пород, которые не позволяют использовать приращения пробоотборников. </ol> 2. Подготовка образцов Шлифовальные диски Поместите диски на шлифовальной машине и молоть поверхность, используя последовательность более мелких абразивов, начиная с бумагой 80-крупяной, затем 120, 220, 300 зернистости. Окончательной полировки с 400 зернистости является достаточным для большинства хвойных пород. Для лиственных пород и особенно тропических видов, использование шлифования крупы до 1200 различать границы роста кольца. Резка плоских поверхностей на ядрах Закрепите ядер прирост основного держателя недавно разработанной основной микротоме, позволяющим сократить плоских поверхностей на ядрах по всей их степени. Примечание: Правильно ориентацию сердечника в держатель, чтобы направление волокон образца вертикальном, что под прямым углом к ​​ножа микротома. Поднимите ядро, пока он слегка не коснется лезвия. Потяните лезвие, закрепленное на шарикоподшипником руководством по степени ядра, восприветствоватьВ ВЫКЛ первую часть сверху. Верните нож за ядро, поднимите держатель образца с ядром около 10 мкм и повторите процедуру резки. У этого примерно до одной трети диаметра сердечника будет сократить в результате чего непрерывной плоской поверхности. Подготовка микро разделы, добавляя кукурузный крахмал решение. Для детального анализа изображения анатомического строения, исправить ядра или другие образцы отделилась от дисков в держателе микротома. Установите микротоме лезвие, руководствуясь шаровой подшипник руководством недавно разработанной санях микротоме на верхней кромке образца и вытащить над ним. Верните лезвие, чтобы поднять образец с 20 до 30 мкм и вытащить нож по образцу снова. Повторите эту процедуру до тех пор, непрерывной поверхностью в верхней части образца не создается. Крышка полученного поверхности раствором кукурузного крахмала (10 г кукурузного крахмала, 8 мл воды и 7 г 100% глицерол) с общим щеткой. ПРИМЕЧАНИЕ: крахмальные зерна заполняют открытые клетки образца, чтобы стабилизировать структуру для последующей резки тонких секций. Поднимите образец, 15 мкм, поместите кисть на поверхности образца и вытащить нож медленно к образцу, начиная отрезать тонкую часть (ниже кисти). При резке в результате раздела скользит по лезвию руководствуясь кисти. Когда весь раздел вырезать, удалить микро участок от лопасти с щеткой и водой (для уменьшения трения) и поместите раздел на предметное стекло для дальнейшей подготовки. Чтобы предотвратить их от высыхания, покройте их с использованием небольшого количества глицерина (33% = одна часть 100% глицерина и двух частей воды). 3. Microslide Подготовка Для дальнейшего получения постоянных слайдов, первый мыть глицерин от микро секции с помощью пипетки и воды. Обложка мокрый себеие с несколькими каплями сафранином (1 г порошка сафранином + 100 мл воды) и Astrablue (0,5 г Astra синего порошка + 2 мл 100% -ной уксусной кислоты + 100 мл воды), чтобы отличить одревесневшие и не одревесневшие структуры, но и для повышения контрастности для последующего анализа изображений. Пусть раздел отдохнуть в течение 5 мин, охватываемых красителя, а затем смыть его с помощью пипетки и снова водой. Как только чрезмерное краситель удаляется, обезвоживают сечение с пипеток промыванием их последовательности 75% разбавленного, 96% и, наконец, 100% -ным этанолом. Использование пипетки для полоскания образцов на предметное стекло вместо размещения образцов в ванну, чтобы сократить время обработки для двух до 3 мин в течение всего процесса дегидратации. ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоживание с этанолом предотвращает хрупкие образцы от разрушения. После этого промойте участок с 100% ксилола. ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилол является канцерогенным и вентиляция обязательна в лаборатории при ее использовании. Другойпродукты существуют замены ксилол, но если есть намерение сохранить образцы в течение длительных периодов времени (годы, десятилетия) для потенциального повторного анализа, Канадский бальзам (шаг 3.5.2) является только вложение среда, которая остается свободной, не меняя цвет с течением времени. К сожалению, Канада бальзам должен быть использован в сочетании с ксилолом. До тех пор, ксилол получается молочный (беловатый), повторить процесс дегидратации, как это не достаточно обезвожен. Как только ксилол остается ясным, покрыть участок с падением 100% канадского бальзама и покрыть ее защитным стеклом, по крайней мере, от размера раздела. ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте удалять пузырьки воздуха, слегка нажав покровного стекла вниз. Поместите в результате микро слайд между двумя полосками термостойких пластмасс и поместить его на металлической пластине. Поместите вес (например, магнит) на верхней части ползуна нажать на нее вниз, чтобы раздел плоским во время следующего процесса сушки. Поместите слайды в духовке при температуре60 ° С в течение приблизительно 12 ч. После 12 часов, принимать слайды из духовки и поместите их на полке дайте им остыть до комнатной температуры (около 20 ° C). Когда остынет, снимите вес и пластиковую полоску и очистить слайд, используя лезвие бритвы, чтобы удалить излишки Канадский бальзам. 4. Визуализация Содержимое ячеек Подготовка Nawashin решение 25. Готовят раствор (A) с 5 г хромовой кислоты, 50 мл 96% -ной уксусной кислоты, и 320 мл деионизированной воды. Подготовьте другое решение (B) с 200 мл формалина с 175 мл деионизированной воды. Смешайте раствор А и раствор В в соотношении 1: 1, чтобы создать решение Nawashin. Для визуализации содержимое ячейки, исправить образца с раствором Nawashin в течение 10 мин, чтобы остановить все процессы деградации в клетке. ПРИМЕЧАНИЕ: фиксация сохраняет клеточные ядра, позволяющие для оценки долговечности клеток (долголетия клеток = ядер, присутствующих / ядра отсутствует; наличие OR отсутствие ядра указывает, является ли ячейка живых или мертвых). После фиксации стирать разделы с водой, чтобы полностью удалить раствор Nawashin до окрашивания их сафранином Astra синий и перед дополнительно окрашивания их с пикриновой анилина синий (1 часть насыщенного водорастворимой Anilin синий + 4 частей 10% пикриновой кислоты) , Осторожно нагревают образец до примерно 80 ° С (в любом случае ниже точки кипения), чтобы ускорить процесс окрашивания. Для обезвоживания и вложение образцов следовать стади 3,4 до 3,8. 5. Подготовка цифровых изображений анатомических особенностей Создание цифровых изображений основных поверхностей для анализа сосудов. Вырезать сердцевину плоской поверхности с помощью основной микротом и окрасить в результате черную поверхность, просто с помощью войлочной маркер. Как только краситель сушат, протереть поверхность сердцевины с мелом. Нажмите мел в клетках, просто потерев мел поповерхность с помощью пальца. Также удалите излишки мела этой процедуры. Примечание: В результате клеточные стенки черно-просвет части сосудов белого цвета. Этот контраст условием для автоматизированного анализа изображений. Поместите подготовленный ядро ​​ниже бинокулярного микроскопа, снабженного цифровой камерой. Возьмем последовательность несколько перекрывающихся (прибл. 10%) изображения, начиная с одной стороны сердечника до тех пор, пока вся поверхность захватывается. Сшейте отдельных изображений, чтобы создать полный образ поверхности ядра. Создание цифровых изображений от микро слайдов Поместите очищенные микро слайды под микроскопом и принять перекрывающихся изображений из всего раздела. Определить удельную увеличение в зависимости от структур, которые будут проанализированы, в диапазоне от 40Х и увеличении 1,000X. Сшейте отдельные изображения для создания одного полного изображения раздела. Чтобы избежать возможных искажений в процессе сшивания, используйте "; План "-типа объективы с микроскопом. 6. Количественная анатомических особенностей Для обнаружения ячеек и границ кольца с помощью ROXAS18 инструмента анализа изображений или аналогичное программное обеспечение, загрузить полный образ микро разделе и связанных с пространственной калибровки для получения количественных результатов в метрических единицах. Рассчитать пространственную калибровки путем измерения количества пикселей между шкалами микрометра этапа изображений, снятых при том же увеличении и деления полученной величины на деления шкалы в метрических единицах (например, 1000 мкм). Выберите из предложенного списка (в программном обеспечении) подходящей конфигурации Перед началом автоматической часть анализа. Примечание: конфигурация ранее оптимальный набор настроек программы, которые, например, учитывает окрашивания цвет образца и от размера и формы спектра клеток, которые будут обнаружены. Индивидуальные конфигурации, таким образом,позволяют производить оптимальных результатов распознавания для различных видов и качества изображения,. Выберите дополнительные опции, такие как использование регионы в изображении, которые должны быть включены или исключены, чтобы избежать, например, пустые поля изображения или трещины в образце, если это необходимо. Начните анализ, нажав кнопку Анализ. Если решили, определения областей в изображении, которые должны быть включены или исключены с помощью полигонов, прямоугольник или круг инструмента. Ниже автоматический анализ использует гибкие алгоритмы, чтобы исправить некоторые недостатки изображения (например, плохой контраст) и улучшить контраст в зависимости от качества изображения.

Representative Results

Все dendroecological анализ зависит от точных образцов, независимо от того, если будут приняты диски, стержни, или микро ядра. Для этого, устройства должны быть в отличной форме (точно заточенным), чтобы избежать микротрещин внутри деревянного образца. При подготовке поверхности, на сердечников приращения, использование основного микротома имеет важное значение. Способность иметь открытые ячейки, которые могут быть дополнительно обработаны для повышения контрастности для анализ изображения и измерения размера судна (рис 1), первым важным шагом на пути к адаптации анатомических структур в анализ временных рядов. Иногда плотность образца лиственной предотвращает использование микротома. В этом случае правильное полировка и последующее удаление избыточной опилок из сосудов с компрессором или пылесосом является наилучшим вариантом. Для более детального изучения небольших клеточных структур, как earlywood и latewood трахеид хвойных, высокое качество микро разделы нужны. Здесь PotentiAl артефакты, такие как стены вторичных клеточных время снял необходимость первой стенки, которых следует избегать (рис 2). Если эти артефакты возникают в цифровых изображений, автоматизированный анализ размеров клеток больше не возможно. Артефакты, то необходимо вручную исправлены, что занимает много времени и в большинстве случаев приводит к неправильному измерению размеров клеток. Простое применение неньютоновской жидкости, то есть решения кукурузный крахмал, в верхней части образца поддерживает стабильность структуры при одновременном снижении появление артефактов к минимуму (рисунок 2) 26. Это приложение кукурузного крахмала, подходит для всех деревянных образцов, включая тропические виды, делает применение процедуры вложения в образцах до резки излишним. Micro разделы позволяют более безопасную определение годовых колец. Это особенно относится к хвойные растут на своих естественных пределов, то есть </EM>, на линии деревьев в районах с высокой альпийских. Очень узкие кольца часто и трудно обнаружить макроскопически (Рисунок 3). В крайних случаях, кольца состоят из одного или двух рядов earlywood клеток и одного ряда уплощенных latewood клеток, которые не имеют (в отличие от обычных latewood клеток) утолщенных клеточных стенок. Для этого они лучше или даже видна только при использовании микро разделов. Кроме того, флуктуации плотности могут быть дифференцированы от границ кольцевых более четко, что упрощает обнаружение годовых колец, особенно в Средиземноморье и тропиках (рисунок 3). При анализе изображения при увеличении 40Х и выше, отдельные клетки могут видеть и толщина их клеточных стенок также обнаружены. Полуавтоматическая программного обеспечения для анализа позволяет измерять конкретных параметров вдоль определенных путей после направления их временной и пространственной развития (рис 4). При этом, чанГЭС отдельных параметров, таких как сотовые просвет или толщины клеточной стенки может быть определена на всем протяжении годового кольца (рисунок 4). Это может быть сделано для всех колец, видимых на изображении, и это полностью поддерживает необходимость расширенного анализа временных рядов. Анализ изображения также может быть использован для определения фазы развития годовых колец в пределах вегетационного периода (рисунок 5). При анализе образа срез окрашивали Safranin и Астра-голубым цветом с помощью поляризованного света, даже различные этапы лигнификации, начиная с крайних углах клеточных стенок до полного одревеснения вторичном клеточной стенки, становятся видимыми. Это потому, что одревесневшие (Mature) клеточные стенки сиять в поляризованном свете (рис 5). Подробная информация может быть связано с экологическими данными документированных за соответствующий период вегетации, чтобы определить, например, более подробная отношений Типы климата рост onship. Рисунок 1. Примеры микро разделе и готовы плоская поверхность из дуба в том числе кольца шириной и измерения размеров судно вышло:. Внешняя часть сердечника дуб приращения. Ядро диаметр 5 мм был разрезан с помощью основной микротома. Поверхность затем окрашивали черным, используя фетровую маркер, и клетки были заполнены с белым мелом после пятно было сухо. Справа: график с указанием кольцевых ширины и размера сосуда измерения сделанные на поверхности ядра, показанном на рисунке слева. Нет микро секции не были необходимы, чтобы сделать эти измерения благодаря ясному поверхности, созданной за счет основного микротоме (с изменениями после 21). Внизу: раздел Micro отрезать ядро ​​приращения, витражи, обезвоженной и фиксируется в канадский бальзам. Толщина: 20 мкм, длина: 25 см. г "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2. Изображения микро сечениях среза без стабилизации сравнении с раздела Резка с использованием кукурузного крахмала решение Слева:. Раздел Micro показывая резки артефакты в earlywood трахеид хвойное дерево. Образец был вырезан без внедрения, и в результате на достаточно тонкие вторичные стенки earlywood клеток отщепляются основной стенки (синие стрелки). Справа: раздел Micro без каких-либо артефактов в earlywood трахеид хвойное дерево. В этом разделе (тот же образец, как показано на фото слева) был сокращен после применения кукурузного крахмала решение с кистью на вершине поверхности образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. ove_content "FO: Keep-together.within-странице =" всегда "> . Рисунок 3. Примеры трудно обнаружить ежегодных границ кольцевых слева: Микро сечение сердечника приращения (здесь: Larix децидуальной), показывающий кольцо границу (черная стрелка), указанную в один ряд уплощенных клеток latewood без утолщения клеточных стенок. Это кольцо не будет видна макроскопически. Справа: Intra-годовые колебания плотности (белая стрелка) широко распространены в средиземноморских видов (микро раздел: Дуб каменный). Постепенное изменение структуры клеток к latewood и обратно earlywood структуры (белая стрелка) позволяет дифференцировать колебания плотности от границ реального кольцо (черная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. <p class="jove_content" fo:keep-together.witХин-страницы = "всегда"> Рисунок 4. Иллюстрация области просвета и измерений толщины стенки в пределах годичного кольца в хвойное дерево Топ:. Вырежьте из изображение, показывающее примерные результаты анализа ROXAS в виде дерева кольца сосны обыкновенной (сосны). Границы кольца приведены в желтый и очертания трахеиды просветах в голубой цвет. Для одной радиальной файл (синий трахеиды Lumina) измеренные толщины клеточной стенки представлена ​​красными кружками. Черный масштаб бар = 100 мкм. Внизу:. Внутригодовые изменения в трахеиды области просвета и толщины трахеиды клеточной стенки для всей годичного Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 5. Examplе формующей годичного. картинку был захвачен под световым микроскопом с поляризованного света от цветного микро-разделе сафранином и Астра-голубой, полученной из микро-ядром пробы на 7 июля-й, 2007 от децидуальной Larix, растущих в Lötschental в 1300 м над уровнем моря. На этой микро-разделе камбиальные клетки, клетки в фазе расширения, клетки в фазе утолщение стенки и зрелые клетки узнаваемы. Касательной ширина изображения охватывает ~ 1 мм ксилемы сечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Проблемы успешной и устойчивой интеграции дерева анатомии в dendroecological исследования являются, кроме разнообразных аналитических задач, в основном из-за технических аспектах. Эти проблемы варьируются от принципа отбора проб подходы к созданию высококачественных микро разделов и их последующий анализ 19.

На первый взгляд, выборка ядер или даже дисков простая процедура, которая, как известно, на протяжении многих лет. Есть много вещей, которые можно сделать неправильно, и небольшая неточность в выборке может привести к серьезным проблемам во время последующих подготовки и анализа фаз. Небольшие неточности, такие как отбор керна, который не точно перпендикулярно к оси штока или с помощью недостаточно заточенный бур не проблема, если целью исследования ограничены позвонить ширины измерений. Однако, когда с целью для микроскопического анализа образцов, неправильное направление дискретизации может привести к оптических искаженийКлеточные стенки, в то время как использование тупых пробоотборников результатов в микротрещин внутри ядра. В результате, при попытке сократить микро участки этих ядер, тонкие участки просто не распадаются и эффективным препарат не гарантируется. То же самое верно и для микро-отбора керна. Тупым кончиком приведет к высоким давлением, когда перфоратор забивается в стволовой древесины. Следовательно, камбия слой будет сжат. Камбиальный клетки (рисунок 5), следовательно сжал и не могут быть проанализированы.

Отбор проб Диск действительно лучшая стратегия при анализе изменения роста, чтобы связать их к изменениям окружающей среды. К сожалению, это просто невозможно принимать диски из всех деревьев, предназначенных для отбора проб для дальнейшего анализа. Тем не менее, особенно в случае тропических дендрохронологии, определенное количество стволовых дисков необходимо в сочетании с сердечниками приращения. Диски используются в качестве основы для определения границы кольца и для этого, чтобы поддержать boundarх годов определяется на основе анализа приращения ядер 12,27,28.

Плюсы и минусы шлифования по сравнению с резки часто обсуждаются 1,11,21. Как упоминалось выше, лучшая процедура всегда зависит от вопроса исследования и параметры, которые будут проанализированы (макроскопических или микроскопических). Если изотопные или химические анализы, по прогнозам, в дальнейшем на этапе работы, это крайне важно, чтобы абразивная пыль создано путем шлифования, которые могут заполнить в ячейку просветах по всей выборке, осторожно удаляют пылесосом или сжатого воздуха.

Резка микро разделов для всех микроскопические анализы наиболее подходящий способ приготовления образцов для дальнейшего анализа. Прежде всего, раздел отрезать образец, который затем может быть сохранена без каких-либо загрязнений для потенциальных дальнейших анализов. Во-вторых эти разделы позволяют измерений с высоким разрешением параметров отдельных клеток. Кроме того, во избежание трудоемкий вложениеТехника с использованием кукурузного крахмала решение 26 для стабилизации клеток является большим преимуществом в микро срезов.

Недостатком микро срезов еще ограниченный размер выборки в результате длительной подготовки. Для реального времени серии анализов возвращение в прошлое на протяжении столетий или даже тысячелетий, есть необходимость в дальнейшем развитии существующих режущих устройств 17,19, но также обработки и анализа 18 изображений. Первый шаг в этом направлении является разработка основного микротоме 21, первоначально производится сократить плоских поверхностей на ядрах (рис 1). Недавние испытания показали возможность сократить микро разделы целых ядер с использованием этого устройства (Рисунок 1).

Высокое качество микро разделах содержится основной принцип для эффективного анализа изображений. Принимая образы под микроскопом является распространенной процедурой 19, но их эффективный анализ еще задача, которая должнав дальнейшем развитии 17. Все существующие системы анализа изображения полуавтоматические, то есть, они должны быть более или менее интенсивно контролируется специалистом. Во многих случаях, изображения должны быть исправлены или даже новые изображения должны сделать, чтобы усилить контрастность для лучшего регистрацией структур со стороны программного обеспечения, без изменения толщины клеточной стенки в пределах изображения.

Специализированный инструмент анализа изображений, такие как ROXAS 18, WinCell или конкретных сценариев для ImageJ 29 в состоянии обеспечить основные анатомические данные, такие как количество клеток, размер клеток, толщины клеточной стенки ячеек и в рамках годичного. Многие дополнительные анатомические показатели, которые имеют отношение к dendroecological контексте может быть вычислена из этих основных измерений, таких как размер наиболее крупных трубопроводов, распределения по размерам трубопроводов, размер earlywood или первой строке трубопроводов, (оптической плотности) древесины, внутри годового профили размера трубопровода и клеточной стенкитолщина и шаблоны группировки трубопроводов (одиночные, мультипликаторов и т.д.).

Использование программного обеспечения ROXAS 18, контуры трубопровода просветах (т.е., вода проведении клеток) и ежегодных границ кольцевых автоматически распознаются и визуально представить в виде накладок более оригинального изображения. Алгоритмы обнаружения для трубопроводов на основе цвета, размера и информации о форме, алгоритмы обнаружения для кольцевых границ на локальном контексте каждого трубопровода. Панель инструментов позволяет вручную улучшить эти результаты непосредственно редактируя функции наложения, т.е., удаление, добавление и изменение границ кольца и трубопровод контуры. После редактирования конечный результат данных, в том числе толщины клеточной стенки (хвойных), автоматически генерируется и сохраняется в электронной таблице. Полностью автоматизированные системы в настоящее время не доступны, даже не для хвойных, показывая относительно простую структуру, но это цель для будущих разработок. Это решительно поддерживаем фуинтеграция LL древесины анатомических параметров в анализ временных рядов.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.

Materials

Increment corer http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article
&id=57&Itemid=88&lang=en
Core-Microtome http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory microtome http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Nawashin solution Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid
Picric-Anilin blue One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol
Safranin Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 
Astra-blue Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 
Ethanol Linear Formula CH3CH2OH 
Xylol (Xylene) Linear Formula C6H4(CH3)2 
Canada Balsam Embedding solution for microscopy
Roxas Software http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell http://imagej.nih.gov/ij/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schweingruber, F. H. . Tree Rings and Environment: Dendroecology. , (1996).
  2. Sheppard, P. R. Dendroclimatology: extracting climate from trees. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).
  3. Wagenführ, R. . Anatomie des Holzes: Strukturanalytik – Identifizierung – Nomenklatur – Mikrotechnologie. , (1999).
  4. Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins. Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).
  5. Rowell, R. M. . Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites. , (2005).
  6. Kaennel, M., Schweingruber, F. H. . Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian. , (1995).
  7. Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., Kienast, F., et al. A changing world: challenges for landscape research. On selected issues and challenges in dendroclimatology. , 113-132 (2007).
  8. Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites. Trees. 21 (2), 141-150 (2007).
  9. Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004. Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).
  10. Treydte, K., et al. Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan. Nature. 440, 1179-1182 (2006).
  11. Heinrich, I., Elias, S. A. Dendrogeomorphology. The Encyclopedia of Quaternary Science. 2, 91-103 (2013).
  12. Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate). New Phytologist. 167, 425-435 (2005).
  13. Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function. Trees. 27, 655-662 (2013).
  14. Fengel, D., Wegener, G. W. o. o. d. . Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , (2003).
  15. Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events. IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).
  16. Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
  17. Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome). Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).
  18. Arx, G., Carrer, M. ROXAS – a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
  19. Schweingruber, F. H. . Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , (2013).
  20. Hoadley, R. B. . Identifying wood: Accurate results with simple tools. , (1990).
  21. Nievergelt, D. The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
  22. Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G., Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology. 6, 96-99 (2008).
  23. Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species. Trees. 22 (2), 237-244 (2008).
  24. Fonti, P., et al. Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings. New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).
  25. Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. . Laboratory techniques in Botany. , (1966).
  26. Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).
  27. De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management. Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).
  28. De Ridder, M., et al. A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central. Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).
  29. Redband, W. S. . ImageJ. , (1997).

Tags

Tree-ring ResearchDendroecologyWood AnatomyEnvironmental Change ReconstructionTree Growth AnalysisMicroscopic AnalysisDigital ImagingTime-series AnalysisWood Anatomical ResearchEcological Information

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gärtner, H., Cherubini, P., Fonti, P., von Arx, G., Schneider, L., Nievergelt, D., Verstege, A., Bast, A., Schweingruber, F. H., Büntgen, U. A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research – How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges. J. Vis. Exp. (97), e52337, doi:10.3791/52337 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image