현대 나이테 연구에서 기술적 인 관점 - Dendroecological 및 목재 해부학 적 도전을 극복하는 방법

1. 샘플링 기법 코어 샘플링 샘플링 나무 줄기를 들어, 각각의 성장 발전을 분석하기 위해 줄기에서 증가 corer를 사용하여 두 개 이상의 코어의 압축을 풉니 다. 일반적인 기후 복원이 기울기 코어 평행을 위해, 예를 들어, 연구 작업에 샘플링의 위치를 다릅니다. 열대 종과 작업 할 때, 적어도 세 개 이상의 코어를 가지고. 날카롭게 증가 corer (직경 5, 10 또는 12 mm)를 사용하고 줄기의 성장 축에 수직 corer를 놓습니다. 참고 : 나무로 시추 할 때의 회전 이외의 corer의 움직임을 방지하기 위해 푸셔를 사용 corer의 제어 및 안정적인 위치를 이동하십시오. 유입 및 속을 통해 줄기에 완전히 보어. 핵심 매우 빽빽한 나무 (즉, 열대 종)에, Diospyrus의 ebenum 같은 핵심도 조밀 한 숲에 수 증가 코어 어댑터 (흑단)와 특수 재구성 톱 몸을 사용합니다. </ 리> 추출기를 사용하여 나무에서 생성 된 코어를 제거합니다. corer을 켜고 줄기에서 제거합니다. 그 핵심에 직접 배치 된 테이프에 작성하여 부드러운 연필을 사용하여 추출 된 핵심에 특정 ID를 추가합니다. 스템의 반대측에있는 절차를 반복한다. 손상을 방지하기 위해 플라스틱 또는 종이 튜브 또는 특수 상자에 트리의 두 샘플을 저장합니다. 주 : 성형에서 코어를 방지하기 때문에 종이 빨대 열대 환경에서 특히 유용합니다. 마지막으로, 나무 지원 빔에 코어 (섬유 방향 수직)를 탑재합니다. 차가운 물에 강한 목재 접착제를 사용하고 건조 할 수 있습니다. 참고 :이 연구의 목적은 더 화학적, 동위 원소 또는 밀도 분석을 포함하는 경우 나무 지원에 코어를 장착하지 마십시오. 이러한 목적을 위해, 오픈 케이블 도관 또는 단일 얼굴 골판지의 코어를 고정합니다. 마이크로 코어 샘플링 특수 펀칭 장치를 사용또는 2mm의 개구와 바늘. 껍질의 두께에 따라 껍질의 필요한 부분을 제거하기 위해 부정 행위를 사용합니다. 전술 한 바와 같이 줄기에 성장 축에 수직 장치를 놓고 깊이 약 2cm로 줄기의 물관에 침투하는 망치를 사용합니다. 도구 내부 결과 마이크로 코어를 끊고 줄기에서 분리 바늘을 돌립니다. 마이크로 원심 튜브에 마이크로 코어를 저장하고 레이블을. 디스크 샘플링 젊고 아름다운 여자와 쓰러진 나무 또는 가능한을 샘플링 할 때 특별한 경우 (특히 열대 지방), 예를 들면, 체인 톱 (성장 축에 수직 단면을) 디스크에 걸릴. 단순히 디스크에 라벨을 추가로 분석 할 때까지 저장합니다. 참고 :이 샘플링 방법이 가장 일반적으로 증가 corers의 사용을 허용하지 않는 모든 건조 죽은, 역사, 고고학 및 하위 화석 재료뿐만 아니라, 매우 조밀 한 활엽수 적용됩니다. </ol> 2. 샘플 준비 디스크 샌딩 샌딩 기계에 디스크를 삽입하고 120, 220, 300 그릿이어서 80 그릿의 사포로 시작 점차 미세한 지립의 시퀀스를 사용하여 표면을 연마. 400 그릿으로 최종 연마는 대부분의 침엽수에 충분하다. 활엽수와 특히 열대 종​​의 경우, 사용은 성장 링 경계를 구분하기 위해 1200 밀가루를 샌딩. 코어에 평면 표면을 절단 자신의 전체 범위에 걸쳐 코어에 평면 표면을 잘라 수 있도록 새로 개발 된 핵심 마이크로톰의 핵심 홀더에 증가 코어를 수정합니다. 주 : 마이크로톰 나이프에 직각 인 직립 샘플의 섬유 방향을 갖도록 홀더 내의 코어의 방향을 교정. 그것은 약간 블레이드에 닿을 때까지 코어를 들어 올립니다. 입방 코어의 범위에 걸쳐 볼 베어링지도 상에 고정 블레이드를 당겨상부의 제 1 부분을 t. 코어 뒤에 칼을 뒤로 밀어 코어와 약 10 μm의 샘플 홀더를 들어 올려 절단 절차를 반복합니다. 코어의 직경의 약 1/3 연속 평면의 결과로 삭감 될 때까지이 작업을 수행합니다. 옥수수 전분 용액을 첨가하여 마이크로 섹션을 준비. 해부학 적 구조의 상세한 이미지 분석을 위해, 코어 또는 다른 샘플 마이크로톰의 홀더에 디스크에서 물적 분할 수정. 샘플의 상단에 새로 개발 된 썰매 마이크로톰의 볼 베어링 지침에 의해 인도 마이크로톰 블레이드를 놓고 그 위에 당깁니다. 약 20 내지 30 ㎛로하여 샘플을 들어 올려 다시 샘플을 통해 블레이드를 끌어 블레이드를 다시 밀어 넣습니다. 샘플의 상단에 연속 표면이 생성 될 때까지이 절차를 반복합니다. 그 결과 옥수수 녹말 용액으로 표면 (옥수수 전분 10g, 물 8 mL를 100 % 글리세의 7g을 커버일반 브러쉬 리터). 참고 : 전분 입자가 얇은 부분의 연속 절단 구조를 안정화 샘플의 오픈 셀을 채우기. 15 ㎛의 샘플에 의해 리프트 샘플의 표면 상에 브러쉬를 배치하고 (브러시 아래) 얇은 부분을 절단하기 시작 샘플을 향해 서서히 블레이드를 당긴다. 절단하는 동안, 결과 부분은 브러시에 의해 유도 블레이드에 슬라이드. 전체 부분이 절단되면, 브러시와 물 블레이드에서 마이크로 섹션을 제거 (마찰을 줄이기 위해) 추가로 준비를위한 유리 슬라이드에 섹션을 배치합니다. 건조 해지는 것을 방지하기 위해, 글리세롤의 소량 (33 % = 100 % 글리세롤의 일부 및 물 두 부분)을 사용하여 커버. 3. 마이크로 슬라이드 준비 영구 슬라이드의 다음과 같은 준비를 위해, 먼저 피펫 물과 마이크로 절에서 멀리 글리세롤을 씻는다. 자체 젖은 커버Safranin 몇 방울 ction의 및 Astrablue (+ 2 ml의 100 % 아세트산의 물 + 100 ㎖의 아스트라 청색 분말 0.5 g) (Safranin 분말을 물 + 100 ㎖ 1 g)을 lignified 비 lignified 구분할 구조뿐만 아니라, 후속 분석을위한 화상 콘트라스트를 향상시키기 위해. 염료에 의해 커버 5 분 섹션 나머지를하자 다시 펫 및 물로 씻어. 즉시 과도한 색소가 제거 될 때, 희석 된 75 %, 96 %의 서열 최종적 100 % 에탄올로 세척하여 피펫으로 탈수 부. 피펫을 사용하는 대신, 전체 탈수 공정에 약 2 분 내지 3까지의 처리 시간을 감소시키기 위해 욕에서 샘플을 배치하는 유리 슬라이드에 샘플을 린스한다. 참고 : 에탄올로 탈수가 파손 깨지기 쉬운 샘플을 방지 할 수 있습니다. 그 후 100 % 크 실롤이있는 부분을 씻어. 참고 : 크실렌은 암을 유발하고 사용할 때 환기가 실험실에서 의무입니다. 다른제품은 크 실롤를 ​​교체 존재하지만, 잠재적 인 재분석 더 긴 기간 (년, 수십 년)을 통해 샘플을 저장하는 의도가있는 경우, 캐나다 발삼 (단계 3.5.2)은 시간이 지남에 따라 색상을 변경하지 않고 명확한 유지 만 포함 매체입니다. 불행하게도 캐나다 발삼은 크 실롤와 함께 사용되어야합니다. 충분히 탈수없는만큼 크 실롤이 (희끄무레) 우유를 회전으로, 탈수 과정을 반복한다. 즉시 분명 크 실롤 채로 있다면, 100 % 캐나다 발삼의 드롭 부 커버 부와의 적어도 크기의 커버 유리로 커버. 참고 : 아래로 부드럽게 커버 유리를 눌러 기포를 제거하는주의하십시오. 내열 플라스틱의 두 조각 사이에 생성 된 마이크로 슬라이드를 놓고 금속판에 놓습니다. 다음 건조 과정에서 평평한 부분을 유지하기 위해 아래로 눌러 슬라이드의 상단에 (예를 들어, 자석) 무게를 놓습니다. 오븐에서에서 슬라이드를 배치약 12 시간 동안 60 ° C에서. 12 시간 후, 오븐에서 슬라이드를 타고 그들을 RT (약 20 ° C)까지 식을 수 있도록 선반에 배치합니다. 차가울 때, 무게와 플라스틱 스트립을 제거하고 잉여 캐나다 발삼을 제거하기 위해 면도날을 사용하여 슬라이드를 청소합니다. 4. 셀 내용을 시각화 Nawashin 솔루션 (25)을 준비합니다. 크롬산 5g, 96 % 아세트산 50 ㎖, 탈 이온수 320 mL를 용액 (A)을 준비한다. 탈 이온수 175 mL를 포르말린 200㎖의 다른 용액 (B)를 준비한다. Nawashin 솔루션을 만들 : 1 비율로 1 용액 A와 용액 B를 섞는다. 10 분은 셀 내의 모든 분해 프로세스를 중지하는 셀 내용을 시각화하기 위해, Nawashin 솔루션 샘플을 수정합니다. 참고 : 고정은 세포의 수명 (전지 수명 = 현재 핵 / 핵이 존재의 추정을 허용 세포 핵을 보존, 존재 오셀이) 살아 있거나 죽어 여부를 핵의 R의 부재를 나타냅니다. 고정 후, 완전히 Safranin-아스트라 파란색과 추가 피크르산 아닐린 블루로 염색하기 전에 (1 부 포화 수용성 아닐린 10 % 피크르산의 블루 + 4 부분)을 염색하기 전에 Nawashin 솔루션을 제거하기 위해 물에 절을 씻어 . 조심스럽게 염색 과정을 가속화 (비점 이하의 임의의 경우)에 대해 80 ° C로 샘플을 가열한다. 샘플의 탈수 및 내장하는 프로토콜은 3.4-3.8 단계를 따르십시오. 5. 해부학 적 특징의 디지털 이미지를 준비 혈관 분석을 위해 핵심 표면의 디지털 이미지를 생성합니다. 코어 마이크로톰을 사용하여 코어 표면을 평면 컷 단순히 펠트 마커를 사용하여 얻어진 표면에 검은 얼룩. 즉시 건조 염료로서, 흰색 분필 코어의 표면을 문질러. 단순히 위에 분필을 문질러 세포에서 분필을 눌러손가락을 사용하여 표면. 또한이 절차에 의해 분필 흑자를 제거합니다. 주 : 셀벽 블랙이고 혈관의 내강 부분 백색 결과. 이것은 콘트라스트를 자동 화상 분석을위한 전제 조건이다. 디지털 카메라가 장착 된 쌍안 현미경 아래 준비 코어를 놓습니다. 약간 겹치는 순서 가라 (약 70도. 10 %) 전체면이 될 때까지 포착 된 이미지는 상기 코어의 일측에 시작. 핵심 표면의 전체 이미지를 만들 수있는 하나의 이미지를 스티치. 마이크로 슬라이드에서 디지털 이미지 만들기 현미경으로 청소 마이크로 슬라이드를 놓고 전체 부분의 이미지를 중첩 걸릴. 구조에 따라 특정 배율을 정의하면 40X 배율 1000 배와 사이의 범위를 분석한다. 섹션의 하나의 완전한 이미지를 만들 수있는 하나의 이미지를 스티치. 바느질 과정에서 가능한 왜곡을 방지하기 위해, "사용; 계획 "현미경의 대물 렌즈를 – 형. 6. 정량화 해부학 적 특징 이미지 분석 공구 ROXAS18 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 세포 및 링 테두리를 검출하기 위해, 마이크로 미터 단위 섹션과 정량적 결과를 얻기 위해 교정 연관된 공간의 전체 이미지를로드. 같은 배율로 촬영과 측정 단위의 규모 간격에 의해 얻어진 값을 나누어 마이크로 미터 스테이지 이미지의 비늘 사이의 픽셀 수 (예를 들어, 1000 μm의)를 측정하여 공간 교정을 계산합니다. (소프트웨어에서 제공) 제공된 목록의 자동 분석을 시작하기 전에 일부 적절한 구성에서 선택한다. 주 : 구성은 예를 들어, 검출 될 고려 시료와 세포의 크기 및 형상 범위의 색 얼룩을 얻어, 프로그램 설정 이전에 최적화 된 세트이다. 따라서 맞춤형 구성다른 종과 이미지 품질을위한 최적의 인식 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 포함 또는 방지하기 위해 제외 할 수있는 이미지의 영역의 사용과 같은 추가 옵션을 선택 예를 들어, 샘플 빈 이미지 마진 또는 균열, 필요한 경우. 분석 버튼을 눌러 분석을 시작합니다. 선택한 경우, 포함 또는 다각형, 사각형 또는 원 도구를 사용하여 배제되어야 이미지의 영역을 정의한다. 다음의 분석은 자동 화상의 품질에 기초하여 콘트라스트를 약간 화상 결함 (예를 들어, 불량한 콘트라스트)를 향상시키기 위해 정정가요 알고리즘을 사용한다.