脊髄圧縮傷害の校正済み鉗子モデル

全ての動物手順や動物のケアの方法には、金融機関の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認されるべきである。 1.外科の準備鉗子、ヴァナはさみ、roungeurs、リトラクター、メス、ハサミ、縫合糸、皮膚ステープル、Q-ヒント、滅菌生理食塩水、外科スポンジ、およびイソフルラン：すべての必要な手術器具および試薬を組み立てます。手術前に手術器具の完全なパックを準備し、オートクレーブ。複数のマウスの手術を実施する場合は、準備し、オートクレーブ動物あたりのツールのいずれかのパケットを、または手術器具の1パケットをオートクレーブ手術の間でツール·滅菌器で滅菌する。ガラスビーズツールterilizerがで中間手術ツールを洗浄するために使用される場合、一般に、滅菌ツールの一つのパック（5匹の動物の後にツールが使用前に再洗浄し、滅菌しなければならない）までの5匹のマウスを使用することができる。 institutiについては、最寄りの動物実験委員会の管理者に確認してください具体的なガイドラインに。 70％のイソプロピルアルコールワイプで手術野を滅菌する。無菌のフィールドが手術中に維持されていることを確認するために手術用ドレープを設定します。 手術前に各マウスを計量。皮下、ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重の用量を投与する。 イソフルラン機械の誘導チャンバ内に4％の用量でイソフルランを投与することによって動物を麻酔する。 動物を麻酔したら、脱水を防ぐため37℃の加熱パッド上で動物を設定し、マウスの頭部が適切に麻酔コーン内に位置されることを保証するために、目に軟膏を適用する。 （注：熱傷を起こさない加熱源を使用します。 すなわち 、循環水の毛布、湯たんぽ、または同等。。）この時点では、動物に2％のイソフルランの用量を投与。 意図された切開の位置の周りの約1cm、マウスの背側表面を削る。 切開Sを駆除ヨウ素溶液（10％ポビドンヨード、1％の有効ヨウ素）、次いで、70％イソプロピルアルコールワイプで洗浄することによって、映像情報メディア学会。 3回繰り返します。 2.背側椎弓切除切開を行う前に、動物が適切につま先やテールピンチ方式を使用して、反射神経をチェックして麻酔されていることを確認する。 メスの刃で背側脊柱に沿って切開を行い、再度反射神経をチェックする。アーチ適切にそのような椎骨の間の境界などのランドマークを、視覚化するために戻って。 皮膚を通ってカット。バック脊髄から皮膚と筋膜を保持するために開創器を挿入します。背骨をカバーするの筋肉を露出させ、脊髄の両側に組織をクリアします。 注：外科医は、解剖学的に精通している必要があり。例えば、肩甲骨の下角は、T7に対応する。マウスの脊椎の自然な曲線の上部はT12であり、基準点として使用することができる。 Pでローパー照明、椎骨の間のスペースを決定する。 T10の後端を検索し、椎間板スペースに垂直に筋肉や筋膜をカット。 T10の棘突起と後部ラミナを露出するためにちょうど十分なカット。 細かい傾いてデュモン＃5ピンセットを使用して、脊髄の小さなスライバーを露出させラミナと棘突起から組織の一部を削除。必要な場合には、脊柱を安定させるために、組織の鉗子を使用しています。 椎骨の背側に沿って、ちょうどラミナの下に小さなヴァナはさみのペアの一方の側を挿入して椎弓切除術を行います。 小さな、慎重な切れ端は、椎弓板の側面を切断することを確認します。全く圧力が脊髄に適用されていないことを確認してください。 反対側に繰り返します。 脊髄に圧力をかけないように注意しながら、Qティップまたは外科スポンジで、必要に応じて出血を止めるための穏やかな圧力を適用します。 注：ゲルフォームを準備出血ニーズを制御することをイベントに滅菌生理食塩水に浸した。 切開が行われた後は、椎骨の背側面を持ち上げ、ゆっくりと任意の組織の添付ファイルを消去する。必要に応じて、出血を制御するための適切な手段を使用してください。 3.脊髄圧迫 roungeursまたは椎弓切除鉗子を使用して、圧迫損傷のためのキャリブレーション鉗子は、脊髄のいずれかの側に置くことができるように、脊髄の側面は、椎骨の自由であることを確認してください。鉗子のアームは、脊柱管の床に到達できる必要があり、隣接する脊髄の側面と鉗子の先端に硬膜外腔内に配置することができなければなりません。 脊髄の視認性が良好であることを確認してください。 脊髄の露出セグメントの途中で5鉗子約校正さデュモン＃を位置づける。思い出してその力の武器psは、隣接する両側に硬膜外腔内に配置する必要があり、ヒントが再現可能な怪我を生成するために、脊柱管の床に触れなければなりません。 スペーサーは接続するまで慎重に脊髄を圧迫する。 15秒間の場所に保持する。 静かに圧縮力を解放し、脊髄から校正された鉗子を削除します。創傷が閉じられる前に、滅菌生理食塩水が恒常性を回復するために使用されるべきである。 4.傷クロージング慎重に崩壊させるまたは脊髄に圧力を加えないように注意しながら、脊髄上筋層を縫合。 創傷の上の皮膚を閉じるには、縫合糸またはステープルのどちらかを使用してください。 ガス麻酔薬を使用する場合は、/テーパー麻酔薬をオフにし始める。 手術中および動物が無気力と負傷から回復している手術後の脱水のためのアカウントを助けるために10グラムの体重あたりの乳酸リンゲルの0.1ミリリットルを管理します。ソリューションは、ヴェルメであるべき注射前に体温dは。 寝具のないケージにマウスを置きます。他の半分は、与えるために、RTカウンタ上に載っている間ケージは、ケージ面積の半分は、パッド上にあることを可能にする様式で（1.1.5に記載のように）加熱パッドの上にくるようにしてくださいマウスの気候のオプションには、歩行したら。 「リカバリケージ」が静かな環境に置かれていることを確実にするために注意してください。それはマウスが寝具との定期的なケージに転送することができ、その時点で意識を、取り戻したまでは密接に動物を監視します。 5.術後ケア痛みの症状を管理するために必要に応じて、手術後、次いで、手術後最初の3日間、ブプレノルフィンの皮下12時間毎に0.05 mg / kg体重の用量を投与し、。 手術後5日 – 第3のための乳酸リンゲル液（10g体重の皮下に0.1 ml）での用量を投与する。この用量を与えるとき、AN / IFimalこの初期期間の外側で脱水の兆候を示すことから始まる。 手動で一日二回クレーデ操縦を使用して動物の膀胱を発現する。静かに膀胱を見つけるために、動物の腹部を触診し、その後膀胱が空になるまで穏やかな下向きの圧力をかける。 膀胱が空でないか、尿が流血や曇りの場合は、10日間腹腔内注射によって動物にバイトリルの体重によって50 mg / kgを管理します。 オートファジー、脱水、および過度の体重減少（体重の20％を超える）の兆候について動物をモニターする。動物がこれらの症状のいずれかが発生した場合の治療オプションに関しては、すぐに獣医師に相談し、またはIACUCガイドラインに従って人道的な方法で、動物を安楽死させるください。 移動度が右手術後に制限されることがあることを考えると、必ず動物は食物および水へのアクセスを持つために必要な措置をとる。同様に、ウェットフードパッケージ済みのヒドロゲルは、これらの例において、動物に利用可能にすることができる。 6.圧縮傷害から生じる組織損傷を評価する ステップ1.4と1.5で説明したように動物を麻酔。つま先のピンチと監視角膜まばたき反射によって麻酔の深さを確認してください。動物が刺激に鈍感である場合には、6.2に進みます。 心臓内灌流10を実行します。 胸腔を露出し、左心室に針を挿入します。氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）の15〜25ミリリットル続く30mlの氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS） – 20と既存の流体を流し出す。 脊髄を削除します。 脊髄に対する皮膚背側をカットし、脊柱の長さを周囲の余分な組織を離れてオフにします。 物品税脊柱、残りの組織を切り取る。椎弓切除と私の実際のレベルnjuryリブをカウントすることによって確認することができる。 尾·ツー·頭側方向に脊柱の小さなセクションを置換するヴァンナはさみとピンセットを使用してください。コー​​ドは安全な除去を可能にするのに十分に露出されるまでカットし続けます。切断位置及びプロセスの可視化は、ステレオスコープを使用することによって容易にすることができる。 4％PFAで脊髄組織を置きます。組織は4℃で24時間、この溶液に、修正を掲示することを可能に。 4℃で24時間、30％スクロース中でインキュベートすることによりCryoprotect組織。 OCTで組織を埋め込む。簡単に言えば、30％のショ糖インキュベーションから組織を取り、余分な溶液を除去する。 10月で満たされたクリオモールドに組織を配置し、4℃で1時間インキュベートする。 4℃から金型を削除し、組織の方向方向を確認（ドライアイス上で1時間予備冷却）2-メチルブタンの浅い皿に金型を入れて、10月には完全に固化することができます。すぐにまたはSTOを使用している場合はドライアイス上で保管してください-80℃で再。 クライオスタットを用いて、20μmの矢状切片に組織を切断。スライド上に直接組織をマウントします。使用するまで-20℃で保管してください。 ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色を行います。 簡単に述べると、組織（5分間、2回）、ヘマトキシリン​​（2.5分）で汚れを再水和、および水（1分、2回）で洗浄した。 50％で組織をインキュベートした後、70％エタノール（3分間ずつ）、エオシン（45秒）と染色、および90％（5秒）、95％（5秒）でのインキュベーションによって脱水、100％エタノール（2分間） 、イソプロパノール（2分）。 キシレン（5分、3回）でクリア。 注：H＆E染色は、特定の組織の厚さおよび状態に応じて変化する。そのため、標準化は実験的な組織サンプルを進める前に必要とされている。 パーマウントの薄いストリップ（〜100ミクロン）で組織し、カバースリップをカバーしています。流体の適切な分布を確実にするためにカバースリップのすべての側面を押し下げます。スライドは、O / Nを乾燥させます。 ビスデジタル顕微鏡を用いて組織切片をualize付属するソフトウェアを用いて画像を取り込む。