معايرة الملقط نموذج من الحبل الشوكي ضغط الإصابات
Summary
Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.
Abstract
إصابات ضغط من الحبل الشوكي الفئران هي نماذج حيوانية قيمة لدراسة إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) والعلاج التجديدي الشوكي. ملقط نموذج معايرة للإصابة ضغط غير مريحة، منخفضة التكلفة، ونموذج حيواني استنساخه جدا لاصابات النخاع الشوكي. كنا زوج من ملقط المعدلة وفقا للطريقة التي نشرتها Plemel وآخرون (2008) لضغط أفقيا الحبل الشوكي لمسافة 0.35 مم. في هذا الفيديو، ونحن سوف يبرهن على وجود الثقب الظهرية لفضح الحبل الشوكي، تليها ضغط على الحبل الشوكي مع ملقط المعدلة. في الفيديو، ونحن سوف تتناول أيضا القضايا المتعلقة رعاية الحيوانات المختبرية مشلول. هذا النموذج إصابة تنتج الفئران التي تظهر ضعف في الإحساس، وكذلك اختلال وظائف hindlimb الحركي. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة من الإصابة ينتج الانحرافات متسقة في علم الأمراض من SCI، على النحو الذي تحدده أساليب المناعى. بعد مشاهدة هذا فيدEO، يجب أن تكون قادرا على تحديد الإمدادات والأساليب اللازمة لإنتاج SCI من مختلف الشدة في الماوس للدراسات عن اصابات النخاع الشوكي و / أو العلاجات تهدف للحد من الانخفاض بعد إصابة المشاهدين.
Introduction
النماذج الحيوانية من اصابات النخاع الشوكي هي أدوات قيمة لتقييم فعالية نماذج علاجية تهدف للحد من الضرر نتيجة لصدمة إلى الحبل الشوكي. بدافع الضرورة التجريبية، يجب أن توفر هذه النماذج العجز استنساخه في الحركي والسلوكيات الحسية، يكون قابل للتعديل لإنتاج إصابات مختلفة الشدة، وتثبت أن شدة الإصابة يرتبط مع درجة العجز العصبية الملاحظة. هناك ثلاثة أنواع رئيسية من SCI مع ميزات متميزة من الإصابة: transection، كدمة، وضغط 1. لفترة وجيزة، وإصابة transection هو تهتك في النخاع الشوكي، وتنشأ الإصابة كدمة من قوة محورية وجيزة تطبيقها على الحبل الشوكي الظهري، ويحدث بسبب اصابة في ضغط عندما يتم تطبيق قوة الضارة إلى الحبل الشوكي، ويمكن أن تكون أيضا يشار إلى إصابة سحق 2.
إصابات transection كاملة نادرة سريريا في البشر 3، في حين كدمة علىإصابات د ضغط هي أكثر شيوعا. إصابة ضغط تنتج هذه النتيجة مشابهة لما هو موجود في SCI البشرية التي تسببها، على سبيل المثال، وضغط الورم أو غيرها من القوات ضغطي الضارة، ويمكن القيام بها باستخدام مجموعة بسيطة من الأدوات. إصابات كدمة وضغط متشابهة في ان كل من هم قوة ضاغطة وكلاهما ميزات المرضية المشابهة، مثل الفوضى التهندس الخلوي، وتثير ردود الذاتية مماثلة لإصابة 1،4. نموذج إصابة كدمة عادة تنطبق عليها هذه القوة إلى الحبل الشوكي الظهري باستخدام جهاز خاص بطريقة مشابهة لحالات الإصابة البشرية SCI الناتجة عن الانحشار من العمود الفقري 2،5،6. في المقابل، يمكن أن تتولد إصابات ضغط من قبل مجموعة متنوعة من أساليب استخدام القوة ظهريا أو أفقيا. وتشمل أساليب اصابة ضغط ملقط 7، مقاطع تمدد الأوعية الدموية معايرة 2، أو وضع الوزن مباشرة على الحبل الشوكي 8. ميزة للمقاطع تمدد الأوعية الدموية هي أنها قادرة على توفير كميات مختلفة من القوة 9. طريقة إضافة الأوزان إلى السطح الظهري للحبل الشوكي مباشرة 8 يتطلب الوزن ليكون في مكان لمدة 10 دقيقة، تزيد بشكل كبير من طول الجراحة ويؤدي إلى التضارب بسبب وضع الوزن والحركة بسبب التنفس من الحيوانات. نظرا لصغر حجم الفئران، والوقع الحيوانات في الأجهزة المتخصصة المصممة للاستخدام في الفئران، مثل الرواطم لإصابات كدمة، قد يكون من الصعب أو تؤدي إلى إصابات لا تتفق 7. ومع ذلك، تتوفر في مجموعة واسعة من السلالات المعدلة وراثيا، على عكس الحيوانات الكبيرة مثل الفئران أو الأرانب التي هي مفيدة جدا للبحث SCI الفئران.
طريقة Plemel استخدام ملقط معايرة لضغط الحبل الشوكي يولد SCI استنساخه مع وجود درجة عالية من الارتباط بين شدة الإصابة والعجز العصبي 7. هذا النموذج SCI الجراحيةتم إنشاؤها باستخدام زوج من رقم 5 ملقط دومون تعديل الذي سيعقد بعيدا على مسافة محددة من قبل أي من الايبوكسي المعدن أو بعض عرقلة أخرى لمنع الإغلاق التام. يضمن هذا التباعد هندسيا أن ملقط سوف دائما قريبة من عرض معين في جراحات متعددة ومختلفة من قبل المستخدمين. الاستفادة من طريقة Plemel هي أن المواد اللازمة لإنتاج ملقط معايرة يمكن شراؤها بسهولة وتجميعها في المختبر دون الحاجة إلى معدات متخصصة. ويمكن لهذه ملقط تحمل جولات متعددة من التعقيم والتعقيم، وعدم وجود والأجهزة الضخمة منفصل يبسط عملية جراحية.
في هذا الفيديو نظهر استخدام الجراحي من زوج من ملقط معايرة على الحبل الشوكي الماوس لتوليد ضغط إصابة. نعالج أيضا المخاوف المتعلقة فريدة لرعاية الحبل الشوكي المصاب الحيوانات المختبرية لتحسين نوعية حياتهم بعد العملية والحد من وفيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختيار نموذج SCI مهم في تصميم التجارب لتحديد مدى فعالية من العلاجات للحالات الإنسانية لاصابات النخاع الشوكي. مثل هذه التجارب تتطلب نموذج حيواني هذا هو تكرار للغاية للحد من التقلبات التي قد تؤدي إلى البيانات غير حاسمة. كما ينبغي لها أن تكون ذات أهمية سريرية لتقييم دقيق لحالة الإنسان أنهم النمذجة. تحقيقا لهذه الغاية، واختيار من اصابة في الضغط أو contusive أكثر من transection هو أكثر ملاءمة 3 سريريا. ومع ذلك، الرواطم والأجهزة انخفاض الوزن عن إصابات كدمة تتطلب استخدام معدات مكلفة ومعقدة. في المقابل، ملقط نموذج معايرة من SCI يستخدم تعديل ملقط التي هي سهلة لتجميع من المواد المختبرية الشائعة، ويتطلب عملية جراحية واحدة فقط خطوة إضافية بعد الظهرية الثقب القياسية لفضح الحبل الشوكي. ومع ذلك، عيب واحد من استخدام هذا الأسلوب هو أن قوة الضغط يطبق دائما أفقيا بدلا من ظهريا، كماوغالبا ما ينظر إليها في الحالات السريرية البشرية من SCI 9، والإصابات الناتجة الضغط باستخدام طريقة تؤثر على أكبر-منقاري الذيلية مدى الأنسجة من النماذج كدمة 1،2. وقد تجلى هذا النموذج من قبل منشئي هذه التقنية، ولنا، لتوليد استنساخه SCI 7،11، ومناسب تماما لحجم الفئران. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج إصابة يسمح للحيوانات التي يتم تقييمها بعد العلاج الجراحة والعلاج باستخدام العديد من الاختبارات السلوكية، مثل باسو ماوس مقياس للتنقل واختبار الشعر فراي فون، للتحقق من أن لفيف من الحيوانات تشترك في نفس شدة الإصابة والعجز العصبية 7،11-13. ويمكن أيضا أن هذه التقنيات نفسها أن تستخدم لتقييم فعالية من العلاجات التي تعطى للحيوانات خلال الدراسات الاستقصائية، والوفاء المعايير العامة لالنماذج الحيوانية المستخدمة لتقييم العلاجات لاصابات النخاع الشوكي 2،7.
طريقة إنتاج forcep معايرةالصورة لنموذج إصابة بسيطة ويمكن تحقيق ذلك مع مجموعة متنوعة من أساليب مختلفة. وقد استخدمنا طريقة فاصل 11، والتي نشرتها Plemel 7، وعدلت أيضا ملقط باستخدام برغي صغير، والذي لا يوفر فقط أسهل طريقة لإنشاء جهاز ضغط، ولكن يسمح أيضا لبراعة في تعديل ضغط العرض النهائي، ل الاستفادة للدراسات المقارنة. مجموعة من الخيارات في خلق ملقط غير محدود تقريبا ما دامت هل (ق) توفر وسيلة مستقرة إغلاق دائما ملقط لنفس المسافة ويمكن أن تصمد أمام التعقيم والتعقيم. الأساليب الجراحية وصفها في هذا الفيديو هي استنساخه للغاية عبر المستخدمين، ولكن من الضروري توخي الحذر عند إجراء الثقب وخياطة الحيوان بعد أن تم تنفيذ الإجراء بحيث لا يعاني الحبل الشوكي أي قوات ضغطي الإضافية التي قد تزيد شدة الإصابة وخلطا بين التجارب المستقبلية. </p>
مع التدريب والممارسة السليم، ملقط نموذج معايرة للإصابة ضغط مناسب تماما لأداء SCI في الفئران التي تحاكي الحالات السريرية التي لوحظت في البشر 2،3،7. نظرا لسهولة خلق ملقط، وتنتج الفئران من درجات متفاوتة من شدة الإصابة يمكن القيام به بسهولة. هذا وسوف تكون ذات فائدة كبيرة لرصد التأثيرات الجينية على SCI من بدرجات متفاوتة من الشدة في الفئران المعدلة وراثيا وكذلك تقييم فعالية زرع الخلايا الجذعية في الفئران. وقد أجريت غالبية الدراسات في الأدب على الفئران بسبب حجمها، الأمر الذي يجعل عملية جراحية عموما أسهل لأداء. لكن الطريقة التي نشرتها Plemel وآخرون. (7) والتي وصفها لنا في هذا الفيديو يجب أن تمكن SCI التي يتعين القيام بها على الفئران مع سهولة كبيرة والتكاثر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work was provided by Shriners Hospitals and CIRM fellowships to AMC and AM. We would also like to acknowledge Plemel et al.7 for first designing and publishing the calibrated forceps model.
Materials
| Name | Company | Catalog No. |
| Isoflurane Machine | Smiths Medical PM, Inc | VCT302 |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical | NDC: 66794-013-25 |
| Dissecting Scope | Seiler Precision Microscopes | SSI 202/402 |
| Germinator-500 (tool sterilizer) | Thomas Scientific | 3885A20 |
| Puralube (Eye Ointment) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
| Scalpel Handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blade (#11) | Fisher Scientific | 08-914B |
| Retractor (Colibri ) | Fine Science Tools | 17000-03 |
| Friedman Pearson Roungeur | Fine Science Tools | 16021-14 |
| Vanna (Castroviejo) Scissors | Roboz | RS-5658 |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11029-14 |
| Laminectomy Forceps (Dumont #2) | Fine Science Tools | 11223-20 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 |
| Staples (wound clips) | Reflex7 | 203-1000 |
| Sutures | Henry Schein | 101-2636 |
| Needles (30 G x ½) | BD Biomedical | 305106 |
| Syringe (1 ml) | BD Biomedical | 309659 |
| Baytril (enrofloxacin) | Bayer | NADA 140-913 |
| Buprenex (buprenorphine) | Cardinal Health | NDC 12496-0757-1 |
References
- McDonough, A., Martinez-Cerdeno, V. Endogenous proliferation after SCI in animal models. Stem Cells Int. 2012, 387513 (2012).
- Onifer, S. M., Rabchevsky, A. G., Scheff, S. W. Rat models of traumatic SCI to assess motor recovery. ILAR J. 48 (4), 385-395 (2007).
- Bunge, R. P., Puckett, W. R., Becerra, J. L., Marcillo, A., Quencer, R. M. Observations on the pathology of human SCI. A review and classification of 22 new cases with details from a case of chronic cord compression with extensive focal demyelination. Adv Neurol. 59, 75-89 (1993).
- Beattie, M. S., et al. Endogenous repair after spinal cord contusion injuries in the rat. Exp Neurol. 148 (2), 453-463 (1997).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe SCI in rats. J Vis Exp. 78, (2013).
- Plemel, J. R., et al. A graded forceps crush SCI model in mice. J Neurotrauma. 25 (4), 350-370 (2008).
- Wu, D., Shibuya, S., Miyamoto, O., Itano, T., Yamamoto, T. Increase of NG2-positive cells associated with radial glia following traumatic SCI in adult rats. J Neurocytol. 34 (6), 459-469 (2005).
- Namiki, J., Tator, C. H. Cell proliferation and nestin expression in the ependyma of the adult rat spinal cord after injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (5), 489-498 (1999).
- Teletin, M., et al. Histopathology in Mouse Metabolic Investigations. Current Protocols in Molecular Biology. 29, (2007).
- McDonough, A., Hoang, A. N., Monterrubio, A. M., Greenhalgh, S., Martinez-Cerdeno, V. Compression injury in the mouse spinal cord elicits a specific proliferative response and distinct cell fate acquisition along rostro-caudal and dorso-ventral axes. 神经科学. 254, 1-17 (2013).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after SCI in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
