Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em> Leishmania</em> Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) gerçek zamanlı ve canlı hayvan, çeşitli biyolojik olayların görselleştirme, izleme ve miktarının mümkün kıldı güçlü optik görüntüleme tekniğidir. Bu teknoloji çok fizyolojik süreçler ve belirli organlarda patojen-aracılı olayların anlayışımızı ilerlemiştir.
Bu çalışmada, IVM fare karaciğer uygulanır ve protokoller tasarlanmış görüntü, in vivo olarak karaciğer dolaşım sistemi ve tek tek hepatik damarlarda kırmızı kan hücresi (RBC) hızını ölçmek. Hepatik organı karakterize Farklı damar alt tiplerini görselleştirmek ve kan akış hızının ölçümlerini gerçekleştirmek için, C57BL / 6 fareleri, damar, karaciğer ile ilişkili damar etiket bir floresan plazma reaktifi ile enjekte edilir. IVM ilgi belirli bir kap içinde vivo, gerçek zamanlı, RBC hızının ölçümünde sağlar. Bu metodoloji kurulması mümkün hale getirecekfizyolojik ve patolojik koşullar altında karaciğer hemodinamik araştırmak. Sonuçta, bu görüntüleme bazlı metodoloji L. etkisini incelemek için önemli olacaktır Karaciğer hemodinami üzerine donovani enfeksiyonu.
Bu yöntem, diğer enfeksiyöz modelleri ve fare organ uygulanabilir ve daha fazla kan akışı üzerindeki etkisinin nicelenmesiyle enflamasyon ile ilgili bir ilacın etkisinin test klinik öncesi da kapsayacak şekilde genişletilebilir.
Introduction
Organ spesifik hemodinamik herhangi bir memeli organı önemli fizyolojik özellikleri vardır. Kan akımı anormallikler inflamasyon sonucu ve organ disfonksiyonu 1 bir işareti olabilir. Böylece, kan akışı organizasyonu, yapısı ve fonksiyonları fizyolojik ve patolojik koşullar altında analiz gibi kritik parametreleri görünür. genel olarak, belirli bir organa kan akışını analiz etmek için kullanılmıştır teknikleri tekniğin kendi çözünürlük sınırını da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara içeren (örneğin, kan akışının Doppler görüntüleme), her kan sadece (hacim mutlak kan akışının ölçülmesi için kapasite bir organ) (örn optik koherens tomografi) ve kan damarlarının 2,3 geniş ve heterojen nüfus hız ortalama değişikliklerin ölçümü hizmet birimi. karaciğerin dolaşım sistemi kendi büyüklüğü, yapısı ve işlevi heterojen farklı damar alt tiplerini bağlar. IçindeBu çalışmada, intravital mikroskobu (IVM) görüntüleme teknolojisi, yüksek çözünürlükte, gerçek zamanlı, in vivo karaciğer hemodinamiği değerlendirmek için uygulanır ve paralel olarak karaciğer organı oluşturan bireysel kan damarlarının özelliklerini ortaya çıkarmak için. Bu güçlü optik görüntüleme tekniğinin son gelişmeler araştırmacı, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte yaşayan hayvanlar dinamik veri toplamak için izin verir. Doğrudan görselleştirme ve in vivo spesifik ve hızlı biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı izleme izin vererek, IVM görüntü bireysel kan damarlarının araştırmacıya eşsiz bir fırsat sunuyor ve ölçmek ve özellikle seçilmiş olan tek kırmızı kan hücrelerinin hızını (RBC) ölçmek hepatik damar.
Bu çalışmada, karaciğer hemodinami hepatotropik Leishmania parazitinin fare enfeksiyon etkisini araştırmak için fare karaciğerinde IVM tekniği hayata geçirdik. L. donovaniviseral leishmaniasis akut-on-kronik inflamatuar tepkileri ile karakterize bir hastalıktır ve dalak ve karaciğer dahil olmak üzere, birden fazla organ, içinde mevcut olan bir patolojiden sorumlu maddedir. Visseral leishmaniasis deneysel fare modelinde, karaciğer enfeksiyonu kendiliğinden çözülmesi dalak enfeksiyonu 4 ilerici ise olduğunu. Hala tam olarak anlaşılamamıştır bireysel organlara göre Leishmania enfeksiyonunun Bu sonuçlar. Patolojik koşullar altında karaciğer ve dalak hemodinaminin incelenmesi konak-parazit etkileşimleri ve hastalık patogenezi üzerine yeni bir ışık tutacaktır.
Bizim deneysel model sistemi maruz bırakılması ve hepatik intravasculature etiketlenmesi için belirli bir floresan boyalar damardan enjekte edildi, bir anestezi uygulanmış fare karaciğer görüntüleme dayanır. Karaciğer içi hayati mikroskopi için olumlu bir organdır. Küçük bir incisio yapıldıktan sonran karın bölgesinde, karaciğer hafifçe dışa ve daha sonra kalp atışı ve solunum nedeniyle herhangi bir hareket eserler azaltılması amacı ile bir lamel, ıslak gazlı bez yerleştirilir. Karaciğer sonra bir mikroskop lenslerin görüş içine yerleştirilmiştir. IVM çalışmaları için, iki foton mikroskopi kullanılmasını gerektirir, dalak ve lenf düğümü ile karşılaştırıldığında, karaciğer avantajı maksimum nüfuz etme derinliği, bilinen bir konfokal mikroskop kullanımı için izin veren homojen bir 3D mimarisi / anatomi yatmaktadır Yaklaşık 50 mikron, intravital mikroskopi görüntüleme 5-8 için.
Bu çalışma, bireysel kan damarlarında RBC hız ve kan akış hızının kantitatif ölçümü için iki bağımsız görüntüleme yöntemleri açıklanır. İlk yöntemde, karaciğer kan akımı zaman içinde xy iki boyutlu bir modu kullanılarak elde edilir. Elde edilen veriler XYT! Tek takibi sağlayan ücretsiz ImageJ yazılımı MtrackJ eklentisi kullanılarak analiz edilirzamanla ual RBCs. İkinci yöntemde ise, tek bir kan damarı seçilir ve karşılık gelen kan akımı konfokal lazer tarama mikroskobu çizgi taraması, hızlı edinim durumuna kullanılarak analiz edilir. ilgi kabı bir eksen hattı boyunca orta ekseni boyunca yüksek frekansta taranır. Kan akış hızı daha sonra, etiketlenmemiş koyu eritrositler ve floresan etiketli plazma arasındaki aksine farka dayanarak ölçülür. çizgi tarama boyunca alınan eritrositler ve plazmanın floresan yoğunlukları çizgiler elde edilmesi için, zamana karşı çizilen, açıları bağımsız bir RBC hızları ile orantılıdır.
Bu makalenin amacı karaciğer bireysel kan damarları içinde görüntüleme için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ve ölçüm kan akış hızı sağlamak ve fare cerrahisi, IVM ve hızının kantitatif analizleri başarılı bir performans için temel araçları kullanılabilir hale getirmektir Bireysel RBCs. TOnun yaklaşımı araştırmacılar patolojik koşullarda kan hızı yeni bakış açıları kazanmak için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare karaciğer intravital mikroskopi son gelişme in vivo ve gerçek zamanlı 5,9,10 enfeksiyona fizyolojik yanıtın araştırılması için yeni olanaklar açar. Organ kan akışı, genellikle pek çok hastalıkta değiştirilmiş bir kritik fizyolojik bir parametredir. Ancak, fizyolojik ve enfeksiyon koşullar altında karaciğer hemodinamiklerin durumu kötü keşfedilmeyi alan kalır. Bu çalışmada, daha önce dalak ve tümör damar sisteminin çalışması için adapte edilmiştir IVM-bazlı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma INSERM, Aix-Marseille Üniversitesi ve CL Forestier ile elde edilen HFSPO bir Kariyer Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
