Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em> Leishmania</em> Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Hemodinámica órgano-específicas son importantes características fisiológicas de cualquier órgano de mamífero. Anomalías en el flujo sanguíneo puede ser la consecuencia de la inflamación y un signo de disfunción de órganos ^1. Por lo tanto, el flujo de sangre organización, estructura y función aparecen como parámetros críticos para el análisis en condiciones fisiológicas y patológicas. Las técnicas que se han utilizado comúnmente para el análisis de flujo de sangre en un órgano específico contienen varias limitaciones, incluyendo el límite de resolución de la técnica en sí (por ejemplo, formación de imágenes Doppler del flujo sanguíneo), la capacidad para la medición del flujo sanguíneo absoluta solamente (volumen de sangre por unidad que sirve un órgano) (por ejemplo, la tomografía de coherencia óptica) y la medición de los cambios en la velocidad promedio en una población grande y heterogéneo de los vasos sanguíneos ^2,3. El sistema circulatorio del hígado vincula diferentes subtipos de los vasos que son heterogéneos en su tamaño, estructura y función. Enesta tecnología de imagen estudio, microscopía intravital (IVM) se aplica para evaluar la hemodinámica del hígado in vivo, en tiempo real, en alta resolución y en paralelo para descubrir las características de los vasos sanguíneos individuales que componen el órgano hepático. El reciente desarrollo de esta poderosa técnica de imagen óptica permite al investigador para recolectar datos dinámicos sobre los animales que viven en una alta resolución espacial y temporal. Al permitir la visualización directa y el monitoreo en tiempo real de los procesos biológicos específicos y rápidos en vivo, IVM ofrece una oportunidad única para el investigador a los vasos sanguíneos imagen individual, y medir y cuantificar la velocidad de los glóbulos rojos individuales (RBC) dentro de un seleccionado específicamente buque hepática.

En este estudio, hemos implementado la técnica de IVM en el hígado del ratón para investigar la influencia de la infección del ratón por el parásito Leishmania hepatotropos en la hemodinámica hepática. L. donovanies el agente responsable de la leishmaniasis visceral, una enfermedad grave caracterizada por respuestas inflamatorias agudas-sobre-crónica y una patología que está presente en múltiples órganos, incluyendo el bazo y el hígado. En un modelo experimental de ratón de leishmaniasis visceral, la infección del hígado es auto-resolver mientras que la infección esplénica es progresiva ^4. Estos resultados de la infección por Leishmania con respecto a los órganos individuales son todavía no completamente entendidos. Investigación de la hemodinámica de hígado y bazo en condiciones patológicas arrojará nueva luz sobre las interacciones huésped-parásito y patogénesis de la enfermedad.

Nuestro sistema modelo experimental se basa en la exposición y la obtención de imágenes del hígado de un ratón anestesiado que recibió la inyección intravenosa de tintes fluorescentes específicas para el etiquetado de la intravasculature hepática. El hígado es un órgano favorable para microscopía intra-vital. Después de realizar un pequeño incision en el abdomen, el hígado se exterioriza y se coloca en una gasa húmeda, luego en un cubreobjetos con el objetivo de reducir los artefactos de movimiento debido a latidos del corazón y la respiración suavemente. El hígado se coloca entonces dentro de la vista de una lente de microscopio. En comparación con el nodo linfático y bazo que requiere el uso de dos fotones para los estudios de microscopía de IVM, la ventaja de que el hígado se encuentra en su arquitectura 3D homogénea / anatomía que permite el uso de un microscopio confocal convencional, con una profundidad máxima de penetración de aproximadamente 50 micras, para obtener imágenes de microscopía intravital ^5-8.

Este estudio describe dos métodos de imagen independientes para la medición cuantitativa de RBC velocidad y la velocidad de flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos individuales. En el primer método, el flujo de sangre del hígado se adquiere usando un modo de bi-dimensional xy con el tiempo. Los datos XYT resultantes se analizan usando el plugin MtrackJ en el software ImageJ libre, que permite el seguimiento de individUAL glóbulos rojos en el tiempo. En el segundo método, se selecciona un solo vaso sanguíneo y su correspondiente flujo de sangre se analiza usando el análisis de la línea modo de adquisición rápida del microscopio de escaneo láser confocal. El vaso de interés se escanea a alta frecuencia a lo largo de su eje central a través de una línea axial. La velocidad del flujo sanguíneo se cuantifica a continuación, en base a la diferencia de contraste entre los eritrocitos y el plasma oscuros sin etiqueta marcada con fluorescencia. Las intensidades de fluorescencia de los glóbulos rojos y el plasma adquiridos a lo largo de la línea de exploración se representan gráficamente contra el tiempo para obtener rayas, los ángulos de las cuales son proporcionales a las velocidades de un RBC individual.

El objetivo de este artículo es proporcionar un método simple y reproducible para la imagen y la medición de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales del hígado y de poner a disposición las herramientas básicas para el buen desarrollo de la cirugía ratón, IVM y análisis cuantitativos de la velocidad glóbulos rojos individuales. Tsu enfoque permitirá a los investigadores a obtener nuevos conocimientos sobre la velocidad de la sangre en condiciones patológicas.