Прижизненные микроскопия Визуализация печени следующие<em> Лейшмания</em> Инфекция: оценка печеночного гемодинамики
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Прижизненные микроскопии (IVM) является мощной техникой оптических изображений, что сделало возможным визуализацию, мониторинг и количественную оценку различных биологических событий в режиме реального времени, так и в живых животных. Эта технология значительно расширили наше понимание физиологических процессов и патогенных-опосредованной явлений в конкретных органах.
В этом исследовании, IVM применяется для печени мыши и протоколы предназначены для изображения в естественных кровеносную систему печени и измерять эритроцитов (RBC) скорость в отдельных сосудах печени. Для визуализации сосудов различных подтипов, которые характеризуют орган печени и выполнять измерения скорости кровотока, мышей C57BL / 6 внутривенно вводили с флуоресцентным плазмы реагента, который маркирует печени ассоциированных сосудистую. IVM позволяет в естественных условиях, режиме реального времени, измерения скорости РБК в определенном судне интересов. Установление этой методологии сделает возможнымисследовать гемодинамику печени в физиологических и патологических условиях. В конечном счете, эта методология визуализации на основе будет иметь важное значение для изучения влияния L. donovani инфекции на печени гемодинамики.
Этот метод может быть применен к другим инфекционным моделей и органов мышей и может быть продлен до доклинических испытаний эффекта препарата на воспаление путем количественного его влияние на кровоток.
Introduction
Органоспецифические гемодинамики являются важными физиологические особенности любого органа млекопитающих. Нарушения в потоке крови может быть следствием воспаления и знак органной дисфункции 1. Таким образом, кровоток организация, структура и функции появляются, как критические параметры для анализа в физиологических и патологических условиях. Методы, которые были широко используется для анализа потока крови в определенном органе содержит ряд ограничений, в том числе предела разрешения самой методики (например, допплерографии кровотока), емкость для измерения абсолютной кровотока только (объем крови в Блок служит орган) (например, оптической когерентной томографии) и измерение средних изменений в скорости в большом и гетерогенной популяции кровеносных сосудов 2,3. Кровеносная система печени в соединяет различные подтипы сосудов, которые неоднородны по своим размерам, структуре и функции. Вэто исследование, прижизненный микроскопии (IVM) Технология формирования изображения применяется для оценки гемодинамики печени в естественных условиях, в режиме реального времени, с высоким разрешением и параллельно раскрыть характеристики отдельных кровеносных сосудов, которые составляют орган печени. Недавнее развитие этой мощной техники оптической визуализации позволяет исследователю собирать динамические данные на живых животных с высоким пространственным и временным разрешением. Позволяя прямой визуализации и реальную контроль времени конкретных и быстрых биологических процессов в естественных условиях, IVM предоставляет уникальную возможность для исследователя к изображению индивидуальный кровеносных сосудов, и измерить количественно и скорость одиночных красных кровяных клеток (эритроцитов) в течение специально выбран печеночная судно.
В этом исследовании, мы внедрили методику IVM в печень мыши, чтобы исследовать влияние инфекции мыши по гепатотропного Leishmania паразитов на гемодинамики печени. Л. donovaniэто агент, ответственный за висцеральный лейшманиоз, тяжелого заболевания характеризуется острым-на-хронических воспалительных реакций и патологии, который присутствует во многих органах, в том числе селезенки и печени. В экспериментальной модели мыши висцерального лейшманиоза, инфекция печени самостоятельно решения, тогда как селезенки инфекция является прогрессивным 4. Эти результаты Leishmania инфекции по отношению к отдельным органам до сих пор не полностью поняты. Исследование печени и селезенки гемодинамики при патологических условиях прольет новый свет на хост-паразит взаимодействия и патогенеза заболевания.
Наша экспериментальная модель системы на основе выявления и визуализации печень наркозом мыши, которые получили внутривенную инъекцию специальных флуоресцентных красителей для маркировки печеночной intravasculature. Печень является благоприятным органом внутри жизненно микроскопии. После выполнения небольшого incisioп в животе, печени осторожно вовне и размещены на мокрой марлей, затем на покровное с целью сокращения каких-либо артефактов движения в связи с сердцебиение и дыхание. Затем печень помещают в поле зрения микроскопа линзы. По сравнению с селезенки и лимфатического узла, которые требуют использования двух фотонов микроскопии для исследования IVM, преимущество печени заключается в гомогенной 3D архитектура / анатомии, что позволяет использование обычной конфокальной микроскопии, с максимальной глубиной проникновения примерно 50 мкм, для прижизненной микроскопии изображений 5-8.
Это исследование описывает два независимых метода визуализации для количественного измерения скорости РБК и скорости кровотока в отдельных кровеносных сосудов. В первом способе, кровоток печени получены с помощью ху би-мерный режим в течение долгого времени. Полученные данные XYT анализируются с помощью плагина MtrackJ в свободное программное обеспечение ImageJ, которая позволяет для отслеживания IndividUAL эритроциты в течение долгого времени. Во втором способе, одного кровеносного сосуда выбрано и соответствующий поток крови анализировали с использованием строчной развертки в режим быстрой приобретения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии-. Судно интерес сканируется на высокой частоте вдоль своей центральной оси через осевой линии. Скорость кровотока затем количественно на основе разницы в контрасте между немеченого темных эритроцитов и флуоресцентно-меченного плазмы. Интенсивность флуоресценции эритроцитов и плазмы, полученных по линии сканирования приведены на время, чтобы получить полосы, углы которых пропорциональны скоростям индивидуальной РБК.
Цель этой статьи заключается в предоставлении простой и воспроизводимый метод для визуализации и измерения скорости потока крови в пределах отдельных кровеносных сосудов печени и предоставлять основные инструменты для успешного выполнения операции мыши, IVM и количественного анализа скорости отдельные эритроциты. Тего подход позволит исследователям получить новые знания скорости кровотока при патологических условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Недавнее развитие прижизненной микроскопии печени мыши открывает новые возможности для исследования физиологической реакции на инфекцию в естественных условиях и в режиме реального времени 5,9,10. Орган кровотока является критическим физиологический параметр, который част…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано INSERM, Университет Экс-Марсель и премии развития карьеры от HFSPO полученной CL Форестье.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
