Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon
Summary
Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.
Abstract
İnsan hastalıkları spesifik nöronal kültürler insan nörolojik hastalıklar için in vitro bir model oluşturmak için gereklidir. Ancak, birincil insan yetişkin nöral kültürlere erişim eksikliği benzersiz zorluklar yükseltir. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin son gelişmeler (iPSC) hastaya özel IPSC yoluyla deri fibroblastlar nöral kültürleri türetmek için alternatif bir yaklaşım sağlar, ancak bu süreç emek yoğundur, özel uzmanlık ve kaynakların büyük miktarda gerektirir, ve birkaç ay sürebilir. Bu nörolojik hastalıkların çalışma Bu teknolojinin geniş bir uygulama önler. Bu sorunlardan bazılarının üstesinden gelmek için, biz iPSC derivasyon işlemini atlayarak, doğrudan insan yetişkin periferal kanından sinir kök hücreleri elde etmek için bir yöntem geliştirdik. Insan yetişkin periferal kanından zenginleştirilmiş hematopötik projenitör hücrelerin in vitro olarak kültürlendi ve Ekim transkripsiyonel faktörler Sox2 içeren Sendai virüsü vektörleri ile transfekte3/4, Klf4 ve c-Myc. ayrıca, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) içeren insan nöral projenitör ortamı kullanılarak seçilmektedir hücrelerinde morfolojik değişiklikler transfeksiyon ile sonuçlanır. Elde edilen hücreler, Nestin ve Sox2 gibi nöral kök hücre işaretçileri için ekspresyonu ile karakterize edilir. Bu nöral kök hücreler ayrıca nöronların, astroglial ve belirtilen farklılaşma medya oligodendrositlere ayırt edilebilir. Kolayca erişilebilir insan periferal kan örnekleri kullanarak, bu yöntem, nörolojik bozukluklar, in vitro model için nöral hücrelere daha fazla farklılaşması için nöral kök hücrelerini elde etmek için kullanılabilir ve bu hastalıkların patojenezinde ve tedavi ile ilgili çalışmalar ilerleyebilir.
Introduction
In vitro nöronal kültürler nörolojik hastalıkların çalışmaları için temel bir araç olarak kullanılmıştır. Birincil hayvan (çoğunlukla, kemirgen) bir sinir kültürlerinin 1, 2 ve gliom ve diğer tümörlerinden türetilmiş insan nöral hücre çizgileri, en yaygın olarak kullanılan bu tür çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte, kemirgen ve insan hücreleri arasında önemli farklılıklar olduğu kabul edilmiştir. Kemirgenler dayalı birçok bulgular insanlara tercüme edilemez. Ayrıca, kitle genomik bilgiler ve nispeten kolay gen düzenleme ve tüm genom sıralamasını analiz hızlı gelişmeler, eğilim daha dişli birkaç insan nöronal kılan, hastalık eğilimli genler keşfetmek ve belirli hastalıklarda işlevlerini ve rollerini ortaya koymayı amaçlayan bir hücre hatları, sadece kullanım sınırlıdır. Teorik olarak, hasta sinir sisteminin örneklerinden elde edilen insan primer sinir kültürleri en iyi seçimdir ama elde etmek imkansız; dolayısıyla alternatif metODS gereklidir. Son yıllarda, bazı yaklaşımlar iki en ayırt olmak, takip edilmiştir. Üretilmesi uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) kullanılarak fare ve insan somatik hücre tekniğin geliştirilmesi eden 3, 4, nöral hücreler, bunlardan 5-7 den daha farklı olabilir. Ancak, üreten ve IPSC karakterize yoğun emek, teknikleri, ve zaman giriş talepleri, hatta bazen engelleyici. Kısa bir süre sonra, bir başka yaklaşım doğrudan somatik hücre 8, 9 ile ilgili nöronal hücrelerini transforme etmek üzere geliştirilmiştir. Elde edilen nöronlar proliferatif olmayan olduğu için, yoğun çalışmalar ve hücre büyük miktarda gerektirir ilaç tarama, içinde bunun uygulanmasını kısıtlar. Her iki teknikler, nöral kök doğrudan türetme avantajları almak için / somatik hücrelerden progenitör hücreleri hala iPSC üretimi ve karakterizasyonu ama yazarlara sıkıcı sürecini atlar çeşitli gruplar 10-12 tarafından araştırılmaktadırdes sonra nöral farklılaşma için nöral kök hücrelerin iyi bir sayı. Biz daha önce hematopoetik progenitör hücrelerin içine Yamanaka transkripsiyon faktörlerinin giriş izleyen, nöral kök hücreler doğrudan ortamı 13 seçerek bir nöral progenitör hücre kullanılarak oluşturulan olabileceğini göstermiştir. Burada, biz detaylı yöntem rapor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğrudan periferik hematopoetik progenitör hücrelerden sinir kök hücreleri üretmek için detaylı bir protokol sağlanır.
Fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında, insan periferal kan daha erişilebilir. Sunulan protokol fazla 1 x 10 5 hematopoietik progenitör hücreler veya CD34 pozitif hücreleri kullanarak, tam kan, 10 ml zenginleştirilebilir. LuM trombosit toplayıcı U kirlenme genellikle önlenebilir olmasa da, kolayca düşük hızlı santrifüj ile a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
