אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב
Summary
שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.
Abstract
תרבויות עצביות ספציפיות מחלות של בני אדם הן חיוניות ליצירת מודלים במבחנה למחלות נוירולוגיות אנושיות. עם זאת, היעדר הגישה לתרבויות עצביות מבוגר אנושי ראשוניות מעלה אתגרים ייחודיים. ההתפתחויות האחרונות בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מספקת גישה חלופית לנובעות תרבויות עצביות מfibroblasts העור באמצעות iPSC הספציפי מטופל, אך תהליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, דורש מומחיות מיוחדת וכמויות גדולות של משאבים, ויכולות לקחת כמה חודשים. זה מונע את היישום הרחב של טכנולוגיה זו לחקר מחלות נוירולוגיות. כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, פיתחנו שיטה להפקת תאי גזע עצביים ישירות מהדם היקפי מבוגר אנושי, תוך עקיפת תהליך גזירת iPSC. תאי אבות היווצרות הדם מועשרים מהדם היקפי אדם הבוגר היו בתרבית במבחנה וtransfected עם וקטורי וירוס סנדאי המכילים Sox2 גורמי תעתיק, אוקטובר3/4, Klf4, ו- c-Myc. תוצאות transfection בשינויים מורפולוגיים בתאים שנבחרו עוד יותר על ידי שימוש במדיום עצבי אנושי המכיל גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF) וכלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF). התאים וכתוצאה מכך מאופיינים בביטוי לסמנים של תאי גזע עצביים, כגון nestin וSox2. תאי גזע העצביים אלה יכולים להיות מובחנים נוספים לתאי עצב, astroglia וoligodendrocytes בתקשורת בידול שצוינה. שימוש בדגימות דם נגיש אנושיות היקפית, שיטה זו יכולה לשמש כדי להפיק תאי גזע עצביים להבחנה נוספת לתאים עצביים לדוגמנות במבחנה של הפרעות נוירולוגיות ועשויה לקדם מחקרים הקשורים להיווצרות המחלה והטיפול במחלות אלה.
Introduction
במבחנה תרבויות עצביות כבר בשימוש ככלי בסיסי ללימודים של מחלות נוירולוגיות. בעלי החיים עיקריים (בעיקר מכרסמים) תרבויות עצביות 1, 2 ושורות תאים עצביות בבני אדם מתוך גליומות או גידולים אחרים הם שימוש נפוץ ביותר במחקרים מסוג זה. עם זאת, זה כבר הכיר בכך שיש הבדלים משמעותיים בין מכרסמים ותאים אנושיים. ממצאים רבים המבוססים על מכרסמים לא יכולים להיות מתורגמים לבני אדם. יתר על כן, עם ההתפתחויות מהירות בניתוח מידע גנומי המוני ועריכת גן קלה יחסית ורצף הגנום כולו, המגמה היא יותר ומכוון יותר לגילוי גנים נוטים מחלה והתוויית הפונקציות ותפקידיהם במחלות ספציפיות, מה שהופך את עצבי האנושיים כמה שורות תאים שרק מוגבלות שימוש. באופן תיאורטי, תרבויות עצביות עיקריות בבני אדם מתוך דגימות של מערכת עצבים מטופל הן הבחירה הטובה ביותר, אבל הם בלתי אפשריים להשיג; ספיד מכאן חלופיods נחוץ. בשנים האחרונות, כמה גישות כבר רדפו, עם שני להיות המובחנים ביותר. בעקבות הפיתוח של הטכניקה של תאים לייצר מושרה pluripotent גזע (iPSC) עכבר באמצעות תאים סומטיים ואדם 3, 4, תאים עצביים יכולים להיות מובחנים נוסף מהם 5-7. עם זאת, יצירה ואפיון iPSC דורשת עבודה אינטנסיבית, טכניקות, וקלט זמן, לפעמים אפילו להחריד. זמן קצר לאחר, גישה אחרת פותחה כדי להפוך ישירות תאים עצביים מהתאים סומטיים 8, 9. כתאי עצב וכתוצאה מכך הם אינם שגשוג, הוא מגביל היישום שלה בלימודים אינטנסיביים והקרנת סמים, אשר דורשת כמות גדולה של תאים. לקחת את היתרונות של שני השיטות, הגזירה ישירה של גזע עצבי / תאי אב מהתאים סומטיים נחקרו על ידי מספר קבוצות 10-12, שעוקפת את התהליך מייגע של דור iPSC ואפיון אבל עדיין provides מספר מכובד של תאי גזע עצביים לבידול עצבי מאוחר יותר. הראינו בעבר כי בעקבות כניסתה של גורמי שעתוק יאמאנאקה לתאי דם, תאי גזע עצביים יכולים להיות שנוצרו ישירות באמצעות תא עצבי בחירה בינונית 13. כאן, אנו מדווחים על השיטה בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול מפורט ליצירת תאי גזע עצביים ישירות מתאי hematopoietic היקפיים מסופק.
בהשוואה לתאים פיברובלסטים, דם היקפי אדם הוא נגיש יותר. תוך שימוש בפרוטוקול שהוצג, יותר מ 1 x 10 5 תאי דם, או תאים חיוביים CD34, יכול להיות מועשר מ 10 מיליליטר ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
