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生物学

El aislamiento de células madre intestinales de Adultos<em> Drosophila</em> Midguts por FACS para estudiar el comportamiento de la célula de vástago durante el envejecimiento

Published: December 16, 2014
doi:
10.3791/52223
, ,
1Institut für Biochemie und Molekulare Biologie,Universität Ulm, 2Institut für Immunologie,Universitätsklinikum Ulm

Summary

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Abstract

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Introduction

Una consecuencia inevitable de envejecer es la capacidad decreciente de los tejidos y órganos para seguir funcionando. Las células madre adultas son esenciales para mantener la homeostasis del tejido y la funcionalidad de órganos, sin embargo como organismos edad, las células madre también experimentan una disminución en su comportamiento biológico. Esto es particularmente perjudicial para los tejidos que tienen una alta tasa de rotación, tales como el epitelio intestinal. Características de las células madre de edad incluyen daño genómico, los mecanismos de reparación deteriorados, regulación del ciclo celular y alteración de las vías de señalización mal regulados, todos los cuales afectan el comportamiento de células madre normal (revisado en 1-3). Mediante la manipulación de las vías de señalización específicas o derribar genes específicos, hemos ganado una idea de su papel en la regulación y el mantenimiento de un comportamiento normal de células madre. Dado que la mayoría de estos experimentos son enfoques molécula candidata, tenemos muy poco conocimiento sobre los cambios moleculares endógenos que se producen en las células madre durantede envejecimiento. Una forma de abordar esta cuestión es comparar el transcriptoma de jóvenes contra las células madre de edad para identificar moléculas cuyo perfil de expresión cambia significativamente durante el envejecimiento. Por desgracia, los desafíos biológicos y técnicos han obstaculizado nuestro progreso con respecto a este enfoque hasta ahora.

Drosophila melanogaster es un organismo modelo muy adecuado para estudiar el envejecimiento, ya que tiene una vida útil corta (alrededor de 60-70 días) y exhibe envejecimiento fenotipos (revisado en 4). Además, el proceso de envejecimiento en Drosophila puede ser acelerado por la temperatura. Al mantener las moscas a 29 ° C, un fenotipo de edad en el tejido intestinal ya se puede observar después de 15 días 5. Además, Drosophila es susceptible de una gran cantidad de manipulaciones genéticas. En particular, el intestino medio Drosophila ha surgido como un excelente sistema modelo para estudiar la influencia de diferentes vías de señalización y desafíos ambientales enla biología de las células madre intestinales (ISCS) durante el envejecimiento (revisado en 6-10). El epitelio intestinal Drosophila tiene una alta tasa de rotación y se renueva cada dos semanas en las mujeres y una vez al mes en los hombres 11. ISC que residen en el intestino medio Drosophila tienen la capacidad de dividirse y producir un ISC auto-renovada y una célula progenitora post-mitótico llamado el enteroblast (EB) 12,13. El EB se diferencia en ya sea un enterocito de absorción o una célula enteroendocrina secretora. A la fecha, la única combinación de marcadores que etiqueta de forma inequívoca el ISC es la expresión de la caracoles factor de transcripción (ESG) y el ligando de Notch Delta (Dl) 14. Sin embargo, esto sólo es válido para un intestino joven y saludable. Durante el envejecimiento, el epitelio del intestino medio se caracteriza por un aumento en la proliferación de ISC 15-17. Además, la señalización de Notch aberrante altera la decisión destino de las células hijas ISCe induce misdifferentiation de EB 15. Esto resulta en una acumulación de células que están activas para la señalización Notch y co-expresa ESG y Dl, haciendo con ello la expresión Dl insuficiente para identificar bona fide células madre en un intestino medio de edad. La dificultad en la identificación de los verdaderos ISC ha impedido la capacidad de examinar los cambios endógenos en los CSI envejecimiento hasta ahora.

Hemos abordado este problema mediante el aprovechamiento de la esg Gal4, UAS-GFP línea de la mosca transgénica en la que el nivel de expresión de GFP en los CSI y EB es intrínsecamente diferente y sigue siendo diferente a lo largo envejecimiento. Un enfoque similar se ha descrito para el aislamiento de neuroblastos de larvas y las neuronas 18,19. Midguts de, moscas-UAS GFP jóvenes y viejos esg Gal4 fueron disecados y se disociaron en células individuales. Las células fueron luego ordenados para las células positivas para GFP usando células activadas por fluorescencia (FACS). Curiosamente, el ordenados GFP-positivo cells distribuidos en dos picos distintos basados ​​en la intensidad de la fluorescencia de GFP (GFP alta y GFP bajo). Además, la distribución de las células positivas para GFP en los dos picos también se correlacionó con el tamaño celular: las células que exhiben baja intensidad de GFP eran pequeñas y menos granular mientras que las células con alta intensidad de GFP eran más grandes y más granular. Esta observación sugiere que los CSI pequeños podían distinguirse de los EBS más grandes usando FACS basado en la intensidad de las buenas prácticas agrarias y la elección de dispersión adecuada frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) ajustes. Curiosamente, los dos picos permanecieron separados claramente durante el envejecimiento. Por otra parte, la relación de los dos picos cambió de una manera que refleja las características antes mencionadas de los intestinos medios de envejecimiento: a saber, que el número de grandes, misdifferentiated aumenta EBS lo largo del tiempo. A partir de estos resultados se concluye que por la clasificación para las células positivas para GFP utilizando los ajustes de los parámetros de FACS adecuadas podemos enriquecer a los CSI y EB en cualquier momento el punto durante el envejecimiento.

En resumen, presentamos una estrategia FACS que permite a los investigadores para enriquecer en dos poblaciones de células diferentes, ISC y EB, de midguts Drosophila de cualquier edad y aislar estas células para su posterior análisis, como la secuenciación de próxima generación. Este método permite poderosa para estudiar los mecanismos moleculares endógenos que son inherentes al envejecimiento en una población enriquecida de células madre o progenitoras. Los datos obtenidos de estos estudios, sin duda, facilitar la identificación de moléculas conservadas que son significativos en el envejecimiento a través de especies.

Protocol

NOTA: Si este protocolo se utiliza por primera vez aislar ISC por FAC clasificación, los siguientes controles son obligatorios con el fin de establecer inicialmente los parámetros de FACS correctamente: Disociar las células de tipo salvaje (por ejemplo w 1118) midguts Drosophila sin Sytox. Disociar las células de tipo salvaje (por ejemplo w 1118) midguts Drosophila con Sytox (ver Paso 3.6). Células disociadas de midguts de la, línea de la mosca-UAS GFP esg Gal4 sin Sytox. 1. Preparación de Soluciones y Vajilla para Disección Gut Preparar 4-6 viales cada 40 mujeres que contiene vuela desde el esg Gal4, línea de la mosca-UAS GFP. De una solución 10x PBS patrón Preparar 500 ml de 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O NaCl, 175 mM, ajustar el pH a 7,4). Preparar un 3,5Solución de agarosa% en 1x PBS (3,5 g de agarosa de grado electroforesis en 100 ml de 1x PBS). Preparar placas de disección vertiendo esta solución en placas de Petri (diámetro 8,5 cm) para cubrir la parte inferior. La capa de agarosa evita dañar las puntas de la pinza durante el procedimiento de disección. Después de que el gel se ha solidificado almacenar las placas de disección a 4 ° C. Preparar 300 ml de PBS 1x + 1% de BSA frescas antes de la disección y colocar la botella en hielo oa 4 ° C. Encienda centrífuga y dejar enfriar a 4 ° C. Flame las puntas de 2 pipetas Pasteur de vidrio para suavizar los bordes. Limpiar dos pares de pinzas y una cuchilla de afeitar con etanol al 70%. Coloque cinco y cincuenta y seis minutos de 1,5 ml tubos de microcentrífuga para recoger midguts disecados en hielo. 2. Preparación del Tracto Gastrointestinal y disección del intestino medio Anestesiar moscas de un vial (40 moscas) con CO 2 en una cama mosca estándar, decapitar a todosmoscas usando una cuchilla de afeitar y transferirlos a la placa de disección. Verter solución / 1% de BSA 1x PBS frío en el plato de la disección para cubrir el gel de agarosa. Las moscas flotarán. Agarrar el abdomen de la mosca con un par de fórceps, mientras mantiene el tórax con el otro par de pinzas. Separar el tórax del abdomen. El intestino será visible y el intestino anterior / cosecha será más probable que se siga conectado al tórax. Coge el intestino y sáquelo del tórax. Para desplegar el intestino, agarra la cosecha y tire de la tripa ligeramente anterior lejos del abdomen. Tome el extremo posterior del abdomen con un par de fórceps y el borde de la cutícula abierta anterior con el otro par de pinzas. Tenga cuidado de no destruir el tejido intestinal que sobresale. Tire del extremo posterior lejos de romper la cutícula y continuar tirando por detrás muy suavemente hasta que todo el intestino ha sido sacado de la cavidad abdominal. El cultivo puede tener que ser eliminado de antemano si es demasiado grande para cabera través de la cavidad del cuerpo. Retire el intestino anterior, tubos de Malpighi, intestino posterior y los ovarios dejando el intestino medio desnuda. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir el lote de midguts disecados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenía solución de BSA 1x PBS / 1% frío y mantener el tubo en hielo. Las muestras deben ser procesadas dentro de 2 horas. Después de la disección de un lote completo es completo, aclare el plato de disección con agua doblemente destilada para lavar izquierda sobre los escombros. Iniciar diseccionar el siguiente lote de midguts (repita los pasos 2.1 a 2.7). Diseccionar tantos lotes como sea posible dentro de 2 horas, a continuación, siga con el paso 3.1. 3. La digestión del tejido intestinal de células Cosecha de FAC Clasificación Eliminar la solución de BSA 1x PBS / 1% de los intestinos medios y añadir 500 l de solución de tripsina-EDTA 0,5% a cada muestra. Vortex así durante 20 segundos y se incuban las muestras por el suave balanceo / que gira a 20 rpm a temperatura ambiente durante 25 a 30 min. Vortex de nuevo después de aproximadamente 30 min y dejar que el tejido intacto fregadero intestino medio a la parte inferior del tubo. Retire cuidadosamente las células que están en suspensión con una pipeta Pasteur de vidrio flameado y filtrar a través de un nylon 35 micras de malla en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos. Haga girar las células hacia abajo a 100 xg durante 5 min a 4 ° C. Es de destacar que cuando se inicia la digestión, un sedimento celular podría no ser visible a simple vista, pero se hará visible como el tejido digerido progresa. Transferir cuidadosamente la solución de tripsina de vuelta al tubo de la muestra original que contiene el tejido del intestino medio intacto restante. Evitar la transferencia de demasiadas células del sedimento. Suavemente volver a suspender el sedimento celular en 400 l de frío 1x PBS / BSA al 1%. Mantener los tubos de microcentrífuga que contiene las células disociadas en hielo y cubrir los tubos con papel de aluminio para proteger las células de la luz. Vortex la solución de tripsina que contiene el tejido del intestino medio intacto restante de nuevo y colocar las muestrasen el eje de balancín durante otros 30 min a temperatura ambiente. Repetir los pasos 3.3 a 3.4.3 hasta que todo el tejido del intestino medio se ha digerido. Combine las células disociadas de todos los tubos de microcentrífuga en un tubo de microcentrífuga. Esto puede requerir una etapa de centrifugación como en 3.4, ya que el volumen de todas las suspensiones de células combinadas puede exceder de 1,5 ml. Mantener la suspensión de células en hielo y proteger las células de la luz. Haga girar las células disociadas abajo a 100 xg durante 5 min a 4 ° C. Retire cuidadosamente tanto del sobrenadante como sea posible dejando aproximadamente 50-100 l de la solución de BSA 1x PBS / 1% en el tubo de microcentrífuga. Resuspender las células disociadas en 800 l 1x PBS / BSA al 1% que contiene Sytox (1: 20.000). Transferir la suspensión celular a un tubo Falcon de 5 ml de fondo redondo mediante la filtración de las células a través de un tapón de resorte filtro de células (malla de nylon 35 micras). Mantenga siempre las muestras de células en hielo y protegido de la luz. Las células están ahora listos paraser resuelto. Pipetear 600 l de solución RNAlater en cada tubo de microcentrífuga en el cual se ordenan las células para el aislamiento de ARN posterior. Para otras aplicaciones posteriores las células se pueden recoger en una solución diferente, por ejemplo, en PBS estéril. 4. FAC Clasificación para aislar células madre intestinales Encender el instrumento de citometría de flujo de al menos una hora antes de la clasificación. Asegúrese de que el sistema de fluido está libre de burbujas de aire. Elija el tamaño de la boquilla 70 micras para inyectar las células en la corriente de fluido de funda. Ajuste de la amplitud de la corriente de fluido de núcleo de modo que el valor de separación corresponde al valor de referencia (6-7, cuando se utiliza la boquilla 70 micras). Deja que la corriente de fluido del núcleo se estabilice antes de comenzar a ordenar. Siga este orden al configurar inicialmente los parámetros para la clasificación: Cargue las células disociadas obtenidos de las tripas de tipo salvaje. En primer lugar, ajustar los voltajes de FSC y SSCpara trazar las células en el centro de la nube de puntos. En segundo lugar, ajustar el (GFP) Tensión de FITC de manera que todas las células se trazan por debajo de 10 2 en el eje x logarítmico. Al establecer el parámetro FITC establece el límite para la autofluorescencia. Cargue las células disociadas obtenidos de las tripas de tipo salvaje con Sytox añaden. Ajuste el valor de Blue Pacific tensión y la puerta para identificar y células de estar separadas de las células muertas, Sytox-positivas en el Blue Pacific vs FSC-A gráfico de dispersión. Cargue las células disociadas obtenidos del esg Gal4, línea de la mosca-UAS GFP sin Sytox y ajustar la tensión de FITC para asegurar que todas las células positivas para GFP se trazan en el gráfico de dispersión. Cargue las células disociadas obtenidos del esg Gal4, línea de la mosca-UAS GFP con Sytox agregó. Ajuste el valor de Blue Pacific tensión y la puerta para identificar y células de estar separadas de muertos, las células Sytox-positivos (puerta P1). Ajuste el SSC-A y FSC-Una puerta para identificar la GFPcélulas positivas (basados ​​en el histograma) según lo determinado por el tamaño y la granularidad (P2 puerta). Establezca la puerta de FSC-H y FSC-W para identificar y excluir dobletes de células GFP-positivas en función de su tamaño (P3 puerta). Ajuste el SSC-H y la puerta SSC-W para identificar y excluir dobletes de células GFP-positivas en función de su granularidad (P4 puerta). Utilice P4 puerta para representar las células positivas para GFP en un histograma que muestra el número de células (COUNT) frente a la intensidad de GFP. Dos picos distintos de células GFP-positivas serán visibles. Crear una puerta para cada pico (puertas P5 y P6). Puerta P5 contiene la población de células que se enriquece por ISC y se puede ordenar por separado de las células en P6 puerta. Back-puerta en un gráfico de contorno para verificar que las dos poblaciones de células positivas para GFP distintas contienen células vivas (comparar con la puerta P1) y células del tamaño correcto (Comparar con puerta P2). Ordena las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 600 & #181; l de solución RNAlater. La clasificación se realiza a una velocidad de flujo baja (máx. 2,0, 70 boquilla m, 1.000 eventos / seg, 70 psi) y empleando una pureza de dos vías tipo. Después de la clasificación se ha completado, vórtice inmediatamente las células clasificadas brevemente y mantener los tubos de microcentrífuga en hielo hasta que de continuar con el aislamiento de ARN u otras aplicaciones posteriores.

Representative Results

Para obtener entre 50.000-100.000 células de FAC de clasificación, entre 160 y 200 midguts necesita ser diseccionado. Obviamente este es el que más tiempo paso de todo el procedimiento. El dibujo muestra en la Figura 1A ilustra los pasos principales de la disección del intestino, que se describen en detalle en el protocolo proporcionado aquí. Este procedimiento puede ser modificada individualmente. A diseccionado, el tracto gastrointestinal entero se muestra en la Figura 1B. Cuando todo el tejido del intestino medio se ha digerido, seguir inmediatamente con la clasificación FAC. Siguiendo la estrategia gating describe en el protocolo permite la identificación con éxito y la clasificación de una población de células enriquecida para ISC y para los EB de Young (Figura 2) y de los intestinos medios de edad (Figura 3). La puerta P1 está definida para incluir sólo las células vivas y saludables a la puerta a las células muertas. Las células que trazan por encima de 10 3 en la logarítmica y-axes cuando se usa el canal azul Pacífico se definen como células muertas. Los puntos que se trama por debajo de 40 en el eje x (FSC-A) son en su mayoría restos y, por tanto, también están excluidos (Figura 2). En el gráfico de dispersión de SSC-A frente a FSC-A las células se distribuyen en función de su tamaño y granularidad. Para una resolución óptima, las células se colocan en el gráfico de dispersión como se muestra en la Figura 2B mediante el ajuste de la tensión del tubo fotomultiplicador (PMT). En los gráficos de dispersión FSC-H frente a FSC-W y SSC-H vs SSC-W células individuales se separan de los agregados y dobletes en función del tamaño (Figura 2C) y en base a la granularidad (Figura 2D). Cuando representa las celdas incluidas en P4 puerta en un histograma, la clara separación de las buenas prácticas agrarias-negativos, GFP bajo (P5 puerta) y pilas de gran GFP (P6 GATE) es visible (Figura 2E). Las células que muestran la intensidad GFP inferior son pequeñas y menos granular y representan los CSI. Las células que exhiben mayor GFP intensity son más grandes y más granular y representan EBS. Transcriptasa (RT) -PCR Inversa de Dl en cDNA sintetizado a partir de ARN de las células de cada población GFP-positivo (puertas P5, P6) reveló que la señal Dl es de hecho más fuerte en las células GFP bajos más pequeños que en el más grande, GFP alta células (Figura 2H). Las células fueron entonces backgated y representan en gráficos de contorno para confirmar que las células GFP bajo (P5 puerta) y GFP alta (P6 GATE) difieren en tamaño y granularidad (Figura 2F) y están todavía vivos (Figura 2G). Es de destacar que los dos picos de células positivas para GFP (GFP bajo y GFP alta) sólo pueden ser bien distinguida si el (GFP) canal FITC se ha calibrado adecuadamente usando los controles descritos en el protocolo. La misma estrategia gating se utilizó al ordenar ISC derivados de las tripas de edad (Figura 3). Los gráficos de dispersión (Figure 3A-D), el histograma (Figura 3E) y los gráficos de contorno (Figura 3F, G) son análogos a los que se muestran en la Figura 2. Como se mencionó anteriormente, no hay ningún marcador fidedigno para identificar los CSI en midguts antiguo y por tanto no hay datos de RT-PCR se presenta aquí. Sin embargo, la observación intrigante aquí es que los dos picos que contienen GFP bajo (P5 puerta) o pilas de gran GFP (P6 puerta) permanecen separadas claramente durante el envejecimiento. Además, el número de células en el alto (P6 puerta) pico GFP aumenta significativamente durante el envejecimiento, que emula claramente la acumulación conocida de EBS misdifferentiated con la edad. El cambio en la proporción de las dos poblaciones de células también se puede ver en los gráficos de dispersión (comparar Figura 3A-D con la Figura 2A-D) y en los gráficos de contorno (comparar Figura 3F, G con la Figura 2F, G). A partir de estos resultados concluimos que clasificar para GFPcélulas positivas utilizando FACS que pueden enriquecer a los CSI y EB en midguts jóvenes y viejos. Para validar la pureza de la CSI y EB aislado, un análisis de tipo poste se realizó (Figura 4). Los histogramas de la CSI y EB-post ordenados (Figura 4 B, C) ​​representan el grado de pureza entre 95% y 98%. Si la jerarquía de configuración de los parámetros de FACS como se describe anteriormente se sigue estrictamente, las dos poblaciones de células diferentes (GFP bajo, pequeño y GFP alta, más grande) ya se pueden distinguir en un gráfico de dispersión GFP frente a FSC-A (Figura 5). Estas dos poblaciones de células no pueden distinguir si se tiene en cuenta esta jerarquía (Figura 5B-D). Figura 1: (A) Un diagrama esquemático de los principales pasos de Dissenexión el intestino mosca. En primer lugar, se retira la cabeza (eliminación de las alas es opcional) seguido por una separación del tórax y abdomen para exponer el intestino. El intestino es posteriormente liberado de la cavidad del cuerpo en los pasos siguientes. Las flechas negras muestran la progresión de la disección, mientras que las flechas de color rojo oscuro denotan la dirección de extracción. Las líneas rojas en la última imagen indican los límites anterior y posterior del intestino medio. Una imagen de microscopio de luz del intestino mosca adulta (B). Las principales regiones y características anatómicas están etiquetados. Las líneas rojas marcan los límites del intestino medio. Figura 2:. FAC clasificación estrategia para identificar y aislar los CSI y EB de jóvenes (7 días) midguts Para una mejor visualización, las células que representan a los CSI se destacan en rojo y las células que representan EBS se destacanen azul en la gráficos de dispersión (AD) y en los gráficos de contorno (F, G). (A) La puerta de P1 está configurado para excluir las células muertas, Sytox-positivos representados por encima de 10 3 en el eje y logarítmica. El umbral de la FSC-A se ha fijado en 40 para excluir también las células muertas y los desechos. (B) Las células fueron cerrada para FSC-A y SSC-A para seleccionar células de acuerdo con el tamaño y la granularidad (P2 puerta). El histograma (E) se utilizó en paralelo para identificar las células GFP-positivas en el FSC-A frente a SSC-A gráfico de dispersión (B). (C, D) Los gráficos de dispersión FSC-H vs FSC-W y SSC-H frente a SSC-W sirven para eliminar los agregados y dobletes y seleccionar para singletes (P3 puerta en C y P4 en la puerta D). (E) El histograma muestra el número de células y su intensidad de GFP. Dos picos, GFP bajo (P5 puerta) y las buenas prácticas agrarias de alto (P6 puerta) pueden distinguirse. (F, G) Las células se volvieron a cerrada en un gráfico de contorno para verificar que las dos células GFP-positivo distinto populatLos iones son del tamaño correcto (F) y contienen células vivas (G). (H) de la transcriptasa inversa (RT) -PCR para Dl en cDNA sintetizado a partir de ARN aislado de las células presentes en el primer pico (P5 puerta) y en las segundo pico (P6 puerta), respectivamente. Más Dl expresión puede ser detectada en las células presentes en la puerta P5 P6 vs. puerta. Tubulina sirvió como control de carga. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: FAC clasificación estrategia para identificar y aislar los CSI y EB de midguts de edad (60 días) Para una mejor visualización, las células que representan a los CSI se destacan en rojo y las células que representan EBS se resaltan en azul en los gráficos de dispersión (AD) y en el. gráficos de contorno (F, G). (A) La puerta de P1 está configurado para excluir las células muertas, Sytox-positivos representados por encima de 10 3 en el eje y logarítmica. El umbral de la FSC-A se ha fijado en 40 para excluir también las células muertas y los desechos. Es de destacar que el aumento dependiente de la edad en las células positivas para GFP grandes ya es evidente en esta parcela. (B) Las células fueron cerrada para FSC-A y SSC-A para seleccionar células de acuerdo con el tamaño y la granularidad (P2 puerta). El histograma (E) se utilizó en paralelo para identificar las células GFP-positivas en el FSC-A frente a SSC-A gráfico de dispersión (B). (C, D) Los gráficos de dispersión FSC-H vs FSC-W y SSC-H frente a SSC-W sirven para eliminar los agregados y dobletes y seleccionar para singletes (P3 puerta en C y P4 en la puerta D). (E) El histograma muestra el número de células y su intensidad de GFP. Dos picos, GFP bajo (P5 puerta) y las buenas prácticas agrarias de alto (P6 puerta) pueden distinguirse. Es de destacar que el alto de células GFP población que contiene células de mayor tamaño ha aumentado inúmero n durante el envejecimiento. (F, G) Las células se volvieron a cerrado en un gráfico de contorno para verificar que las dos poblaciones de células positivas para GFP distintas son del tamaño correcto (F) y contienen células vivas (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:. Un análisis post especie se realizó para determinar la pureza de la CSI y EB células aisladas (A) GFP-positivas de jóvenes (7 días) y de edad (60 días) midguts fueron FAC ordenadas y los histogramas muestran su distribución en dos picos basados ​​en la intensidad de GFP. (B) El análisis post especie demuestra la pureza de los ISC aisladas de midguts jóvenes y viejos, que es> 97%. (C) El análisis post especie de ordenada EB de midguts jóvenes y viejos muestra una pureza> 95%. Las impurezas leves pueden resultar de la extinción de la fluorescencia o células que expresan GFP dañadas mecánicamente causados ​​por la re-clasificación de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Ejemplos de diagramas de dispersión que muestran los datos de FACS subóptimos, que se ve cuando los parámetros de FACS no se establecieron correctamente (A) perfil Representante FACS de todas las células cuando los parámetros de FACS se establecieron adecuadamente sobre la base de los controles descritos en el protocolo.. La población de células que contiene ISC es un círculo en rojo y la población de células que contienen EBS está encerrado en azul. Las células de un círculo en verde son las células muertas que tienen una autofluorescencia más fuerte en comparación concélulas vivas, que se trazan por debajo de 10 3 en el eje y logarítmica. (B) El gráfico de dispersión muestra un resultado típico obtenido cuando el instrumento FACS no fue calibrada. No se detectan células GFP-positivas. (C) Si el FSC no está configurado correctamente, las diferentes poblaciones de células positivas para GFP no se detectan. (D) Si el (GFP) canal FITC no se ajusta correctamente, la mayoría de las buenas prácticas agrarias células positivas a clasificar no se representan en el gráfico de dispersión, sino más bien a lo largo del borde superior de la parcela. También, en la trama que se muestra aquí, el límite para la autofluorescencia no se corrigió, por lo tanto, las células que gráfico de arriba 10 2 en el eje y logarítmicas son en realidad autofluorescente y podría ser confundido con células positivas para GFP.

Discussion

El protocolo presentado describe un método para aislar los CSI de jóvenes y viejos adultos midguts Drosophila, que pueden utilizarse posteriormente para otros análisis moleculares, tales como la secuenciación de próxima generación. FAC clasificación de la población de células GFP-positivo de la esg Gal4, línea de la mosca-UAS GFP ya ha sido alcanzado por varios grupos 21,22. Sin embargo, hasta ahora la presencia de los dos picos distintos de células GFP-positivas ha sido ya sea alto o infravalorado. Se demuestra que esta separación no sólo representa dos poblaciones diferentes de tipos de células (ISCS y EBS), sino también que los dos picos de células GFP-positivas se mantienen claramente separada durante el envejecimiento. Esta observación es muy relevante y valiosa para los investigadores interesados ​​en el estudio de las células madre o progenitoras durante el envejecimiento. El aislamiento de los CSI de midguts viejos se ha visto obstaculizada por el hecho de que no existe una combinación de marcadores moleculares para identificar los CSI en un intestino medio de edad. El único marcador que uidentifica nambiguously ISC en una antigua intestino medio es fosfo-histone3 (PH3), ya que los CSI son las células sólo se dividen en el intestino medio 12,13. Sin embargo, PH3 es un marcador inadecuados para aislar ISC ya que el número de la división de células madre en cualquier punto de tiempo dado es demasiado bajo con el fin de obtener una buena cantidad de ISC para análisis posteriores. El esg línea de la mosca Gal4, UAS-GFP es la línea de la mosca más común utilizado por los investigadores que estudian ISC función, el mantenimiento y la diferenciación. Nuestros conocimientos actuales sobre la regulación molecular de los CSI homeostasis se basa en estudios en los que las moléculas específicas y vías de señalización han sido manipulados (revisado en 7). Por lo tanto, todavía nos falta conocimiento sobre los cambios moleculares endógenos que se producen durante el envejecimiento. El método aquí descrito se cierra esta brecha y se basa en el hecho de que los CSI se puede aislar con base en su tamaño, la granularidad y la intensidad de GFP midguts adultos en cualquier punto de tiempo durante el envejecimiento.

Mientrasestablecer y optimizar este método hemos encontrado los siguientes pasos para ser críticos para un resultado confiable. Aproximadamente 200 tripas necesitan ser diseccionado a fin de obtener una buena cantidad de CSI para la clasificación FAC. La velocidad de la disección es crucial y depende de la práctica del individuo. Una persona entrenada puede diseccionar 40 tripas dentro de 20-30 min. Desde GFP se expresa también en los túbulos de Malpighi en la esg Gal4, UAS-GFP línea de la mosca, es esencial para eliminar completamente los túbulos de Malpighi del intestino medio. Los midguts disecados deben mantenerse en un ambiente fresco para evitar la degradación del tejido y reducir la actividad RNAsa en el tejido. Por lo tanto, los intestinos medios disecados deben ser transferidos desde el plato de la disección en tubos de microcentrífuga que contiene solución fría / 1% de BSA 1x PBS después de un máximo de 20-30 min y se mantuvieron en hielo. Sin embargo, los intestinos medios disecados no deben dejarse en hielo durante más de 2 horas antes de iniciar la disociación del tejido con tripsina. El más efficienfoque ent es diseccionar tantos lotes de moscas como sea posible dentro de estas 2 horas, a continuación, iniciar la digestión con tripsina para estos lotes. Si se necesitan más midguts, pueden ser disecados durante los tiempos de incubación de la digestión con tripsina.

Aunque tripsina es una enzima muy potente y podría tener efectos perjudiciales sobre las células, obtuvimos todavía viva lo suficiente, las células sanas para su posterior clasificación FAC. El paso clave de nuestro procedimiento que permite el aislamiento de células intactas es que las células disociadas se eliminan de la solución de tripsina cada 30 min. Si los intestinos medios disecados se incuban durante 2 ½ horas en un tripsina que contiene la solución a temperatura ambiente, se observó un aumento del 20-30% en las células muertas, Sytox-positivos. Cabe señalar que la solución de tripsina usamos contiene EDTA. La presencia de EDTA probablemente facilita la desintegración de los tejidos al quelar iones calcio y magnesio necesarios para el correcto funcionamiento de las moléculas de la matriz extracelular. </p>

Los pasos más importantes de éxito especie ISCS de tripas jóvenes y ancianos son los ajustes iniciales apropiados de la FACS y parámetros de compuerta utilizando los controles descritos y siguientes una jerarquía de clasificación específico. Se realizó el FAC de clasificación en una ARIA II citómetro de flujo (software FACSDiva). Es importante que el instrumento se enciende al menos una hora antes de la clasificación para calentar los láseres. Es de destacar que cuando se realiza FAC clasificación de los CSI, por primera vez, los parámetros para la clasificación y para la compensación deben establecerse mediante los controles antes mencionados: (1) disociado células de tipo salvaje (por ejemplo w 1118) midguts Drosophila sin adición de Sytox – establecer este parámetro (Paso 4.4.1) impide clasificar las células en función de su autofluorescencia; (2) las células de tipo salvaje (por ejemplo w 1118) midguts Drosophila disociado con Sytox añadió – el establecimiento de este parámetro(Paso 4.4.2) permite separar muertos de células vivas (células muertas tienen una alta autofluorescencia y pueden contaminar las células GFP-positivas ordenados); (3) disociado células del intestino medio de la esg Gal4, línea de la mosca-UAS GFP sin Sytox – establecer este parámetro (Paso 4.4.3) se asegura de que todas las células positivas para GFP se representan en el gráfico de dispersión. Si estos parámetros no se establecen correctamente, la población de células ordenada lo más probable contener células muertas y los desechos (Figura 5 B, C), muchas células GFP-positivas serán perdidas (Figura 5D) y los dos picos distintos de células positivas para GFP como visto en el gráfico de histograma no serán detectados (Figura 2E y la Figura 3E). Una vez que los FACS y parámetros de activación periódica se han fijado, el instrumento está calibrado y listo para ordenar las células de la Gal4 esg, línea de la mosca-UAS GFP. Dado que estos parámetros se pueden guardar, todos los futuros clasificación sesiones para los CSI y EB de la esg Gal4, UAS-Línea de la mosca GFP puede comenzar desde el paso 4.5. Aunque la elección del modo de "pureza" y la realización de una pureza de dos vías tipo disminuye el número de células clasificadas, que permite una mayor rigurosidad de clasificación (Paso 4.6 y la Figura 4B, C). De la nota, la ventaja de utilizar Sytox en lugar de yoduro de propidio para marcar las células muertas es que hay sólo un bajo desbordamiento en el canal FITC (GFP), lo que hace que sea fácil para compensar el desbordamiento.

Nuestro método de enriquecer para ISC y EBS, respectivamente, se basa en la clasificación de las células de acuerdo con diferentes niveles de expresión de GFP. Puede ser que durante el envejecimiento de la misdifferentiated EBS también expresa GFP en un nivel inferior y podría ser confundido como ISC. Sin embargo, ya que las células clasificadas también difieren en tamaño y granularidad, creemos que nuestra estrategia de clasificación es el más adecuado para esta fecha para enriquecer los CSI y EBS. Además, se sabe que las células en un intestino medio de envejecimiento de retención identidad ISC tienen un pequeño núcleo 15. Para obtener más claridad sobre la identidad de las células clasificadas, se podría clasificar células de una línea transgénica mosca que lleva ESG Gal4, UAS-GFP y un reportero transgén de señalización Notch. Puesto que la muesca se ha demostrado ser activo sólo en EBS 12,13, ISC aislado de un joven intestino medio sería negativo para el reportero Notch, mientras que los EBS serían positivos para el reportero de Notch. Sin embargo, durante el envejecimiento de señalización Notch aberrante se convierte en el tejido del intestino medio. Por lo tanto, tiene que ser probado si este montaje experimental es de hecho más fiable para distinguir entre los CSI y EB aislado de un viejo intestino medio.

Ya hemos utilizado este enfoque para el análisis del transcriptoma comparativo de los CSI de midguts jóvenes y viejos e identificado una serie de factores que son regulados diferencialmente durante el envejecimiento (no publicados. Observ.). Además, este método permite el análisis de las diferencias en la expresión génica entre los CSI y el EBS. Tal investigacións va a dar una idea de los cambios moleculares iniciales que se producen como una célula entra en el proceso de diferenciación. Además, el aislamiento de los EB durante los análisis de envejecimiento y posteriores arrojará luz sobre los cambios moleculares de misdifferentiation inducida por la edad. Además, este método se puede combinar con otras herramientas genéticos utilizados en Drosophila para estudiar la función de genes. En resumen, este método ofrece un enfoque imparcial para investigar las características moleculares y los cambios de los CSI y EBS durante el envejecimiento. Esta es una valiosa herramienta que facilite la exploración de mecanismos de envejecimiento en las células madre y progenitoras adultas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 Fine Science Tools 11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) Sefar 3A03-0150-102-00
Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
Polymax 1040 Heidolph 543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054 Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry Life Technologies S34857
RNAlater Stabilization Solution Life Technologies AM7023  other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter Becton Dickinson Turn on one hour prior to sorting
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References

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Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging. J. Vis. Exp. (94), e52223, doi:10.3791/52223 (2014).
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