大人から腸管幹細胞を単離<em>ショウジョウバエ</em> FACSによる中腸は老化中の幹細胞の挙動を研究するために

FACの仕分けから50,000〜100,000細胞間で取得するには、160〜200中腸を切開する必要がある。これは明らかに全体の手順の中で最も時間のかかるステップです。 図1Aに示した漫画は、ここで提供されたプロトコルに詳細に記載されている腸切開の主要なステップを示す。この手順は、個別に変更することができる。解剖し、全消化管は、 図1Bに示されている。 中腸組織のすべてが消化されたときは、すぐにFACの仕分けを続行。プロトコルに記載のゲーティング戦略に続いて成功した同定を可能にし、若い（ 図2）から、古い中腸（ 図3）からのISCのためにとEBSの濃縮された細胞集団の選別。 P1のゲートのみ健康生細胞と死細胞をゲートアウトするために含まれるように設定されている。対数Y-AXで10 3上記の細胞プロットパシフィックブルーチャネルを使用する場合では、死細胞として定義される。したがって、ほとんど破片であり、x軸（FSC-A）40下のプロットの点も（ 図2A）は除外される。 FSC-A対SSC-Aの散布図では細胞は、その大きさや粒度に基づいて配布されます。光電子増倍管（PMT）の電圧を調整することにより、 図2Bに示すように、最適な解決のために、細胞は散布図内に配置されている。 SSC-W対FSC-WとSSC-H対散布図FSC-H、単一の細胞が（ 図2C）サイズに基づいて凝集体および二重線から分離され、粒度（ 図2D）に基づく。ヒストグラムプロット内のゲートP4に含まれるセルを描いたときに、 低 GFP陰性、GFP（ゲートP5）の明確な分離と高い GFP（ゲートP6）細胞（ 図2E）に表示されます。下のGFP強度を示す細胞は小さく、少なく粒状であるとのISCを表します。高いGFPのint型を示す細胞ensityはより大きく、より粒状であるとしたEBを表します。各GFP陽性集団の細胞のRNAから合成したcDNA上のDI用転写酵素（RT）-PCRリバース（ゲートP5、P6）がDL信号が大きく、GFP 高よりも小さく、GFP low細胞において確かに強力であることを明らかにした細胞（ 図2H）。次いで、細胞をGFP 低い （ゲートP5）とGFP 高い （ゲートP6）細胞サイズおよび粒度（ 図2F）が異なり、まだ（ 図2G）生存していることを確認するために等高線プロットにbackgatedと示された。 FITC（GFP）チャネルプロトコルに記載のコントロールを使用して適切に較正されている場合は注目すべきことに、GFP陽性細胞（ 高い GFP 低 GFP）の2つのピークのみをうまく区別することができる。 古いガッツ（ 図3）に由来するのISCをソートするとき、同じゲート戦略を使用した。散布図（FIGUR電子3A-D）、ヒストグラム（ 図3E）と等高線プロット（ 図3F、G）は、図2に示したものに類似している。上述したように、したがって、そこに古い中腸でのISCを識別するためのない真正なマーカーがなく、無RT-PCRデータは、ここに提示されている。しかし、ここで興味深い観察は、GFP 低い （ゲートP5）またはGFP 高 （ゲートP6）細胞を含む二つのピークがはっきりと高齢化の間に分離されたままということです。さらに、GFP 高い （ゲートP6）における細胞の数は、ピークが顕著に明らかに年齢とともにmisdifferentiated EBの既知の蓄積をエミュレートしている、熟成中に増加する。 2つの細胞集団の比率の変化はまた、散布図（ 図2A-Dと図3A-Dを比較）及び等高線プロット（ 図2F、Gで図3F、Gの比較）において見られる。これらの知見から、我々は、GFPのためにソートすることによってことを締結私たちは老いも若きも中腸内のISCとEBSの豊かにすることができ、FACSを使用して陽性細胞。 孤立のISCとEBの純度を検証するために、ポストソート分析は（ 図4）を行った。ポストソートのISCとのEB（ 図4B、C）のヒストグラムプロットは、95％と98％の間の純度を示す。 上記のようにFACSパラメータを設定する階層が厳密に続いている場合、（GFP、 低小さく、GFP 高く 、それ以上）の2つの異なる細胞集団がすでにFSC-A（ 図5A）対散布図GFPに区別することができる。この階層は（ 図5B-D）は無視されている場合は、これら2つの細胞集団を区別することはできません。 図1：（A）ディッセの主要なステップの概略フライ腸をテレビや。まず、ヘッドが腸を露出する胸部と腹部の分離に続いて（羽の除去は任意である）を除去する。腸は、その後、次の手順で体腔から解放されます。暗赤色の矢印は引っ張り方向を表すのに対し、黒矢印は、解剖の進行を示している。最後の画像の赤い線は、中腸の前方および後方の境界を示している。（B）大人のハエの腸の光顕微鏡画像。メイン領域及び解剖学的特徴は、標識されている。赤い線は中腸の境界をマークします。 図2：FACは若い（7日間）中腸からのISCとしたEBを同定および単離するための戦略をソートするより良い視覚化のために、のISCを表す細胞は赤色で強調表示されているとしたEBを表すセルが強調表示されます。散布図（AD）における青色及び等高線プロット（F、G）中で（A）P1のゲートは、対数y軸に10 3上にプロットされた死んだ、SYTOX陽性細胞を除外するように設定されている。 FSC-Aの閾値はまた、死細胞および残骸を排除するために40に設定されている。（B）細胞を、サイズおよび粒度（ゲートP2）に応じてセルを選択するためにFSC-AおよびSSC-Aについてゲーティングした。ヒストグラムプロット（E）は、SSC-散布図（B）対FSC-AにおけるGFP陽性細胞を同定するために並列で使用された（C、D）FSC-W対散布FSC-H及びSSC-W対SSC-Hは、（DにおけるC及びゲートP4ゲートP3）凝集体および二重項を削除し、シングレットを選択するために役立つ。（E）ヒストグラムプロットは、細胞の数およびそれらのGFP強度を示す。二つのピーク、GFP 低い （ゲートP5）と高い GFP（ゲートP6）を識別することができる。（F、G）細胞は、二つの別個のGFP陽性細胞populatことを確認するために、等高線図には、ゲートした最初のピーク（ゲートP5）に存在する細胞から単離されたRNAから合成したcDNA上のDIための逆転写酵素（RT）-PCRとのイオンが正しいサイズ（F）のものであり、含まれている生細胞（G）（H）それぞれ第二のピーク（ゲートP6）、。以上のDI発現ゲートP6対ゲートP5に存在する細胞で検出することができた。チューブリンをローディング対照とした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3：FACが古い（60日）中腸からのISCとしたEBを同定および単離するための戦略をソートするより良い視覚化のために、のISCを表す細胞は赤色で強調表示されているとしたEBを表す細胞は散布図（AD）にし、青色で強調表示されます。等高線プロット（F、G）。（A）P1のゲートは、対数y軸に10 3上にプロットされた死んだ、SYTOX陽性細胞を除外するように設定されている。 FSC-Aの閾値はまた、死細胞および残骸を排除するために40に設定されている。注目すべきは、大きなGFP陽性細胞における年齢依存性の増加が、このプロットにすでに明らかである。（B）細胞サイズおよび粒度（ゲートP2）に応じてセルを選択するためにFSC-AおよびSSC-Aについてゲーティングした。ヒストグラムプロット（E）は、SSC-散布図（B）対FSC-AにおけるGFP陽性細胞を同定するために並列で使用された（C、D）FSC-W対散布FSC-H及びSSC-W対SSC-Hは、（DにおけるC及びゲートP4ゲートP3）凝集体および二重項を削除し、シングレットを選択するために役立つ。（E）ヒストグラムプロットは、細胞の数およびそれらのGFP強度を示す。二つのピーク、GFP 低い （ゲートP5）と高い GFP（ゲートP6）を区別することができる。注目すべきは、より大きな細胞を含む細胞集団GFPの高い i は増加している高齢化の間にn個。（F、G）細胞は、2つの異なるGFP陽性細胞集団は正しいサイズ（F）のものであり、生きた細胞（G）が含まれていることを確認するための等高線図には、ゲートした。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。 図4：ポストソート分析は孤立のISCとEBの純度を決定するために実施した（A）GFP陽性若いから細胞（7日間）と古い（60日）中腸FACはソートされ、ヒストグラムプロットは、その分布を示した。 GFP強度に基づいて二つのピークに。（B）ポストソート分析は> 97％であり、老いも若きも中腸からの孤立のISCの純度を示している。（C）ソートされたEのポストソート解析老いも若きも中腸からのBsは> 95％の純度を示しています。わずかな不純物が蛍光消光または細胞を再ソートすることによって引き起こされる機械的に損傷したGFPを発現する細胞から生じ得る。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図5：FACSパラメータが正しく設定されていなかったときに見ている次善のFACSデータを示して散布図の例としては 、FACSパラメータはプロトコルに記載の制御に基づいて適切に設定されたすべての細胞の（A）代表FACSプロファイル。。のISCを含む細胞集団は赤で丸で囲まれているとしたEBを含む細胞集団は、青い丸で囲まれている。緑色の丸で囲ま細胞はに比べて、より強い自己蛍光を持って死んだ細胞である対数y軸に10 3の下にプロットされている生きた細胞、（B）散布図FACS機器のキャリブレーションされなかった場合に得られる典型的な結果を示している。いいえGFP陽性細胞が検出されない。FSCが正しく設定されていない場合は、別のGFP陽性細胞集団が検出されない（C）（D）FITC（GFP）チャネルが正しく調整されていない場合は、GFP-の大部分をソートされる陽性細胞は、散布図ではなく、むしろ、プロットの上縁に沿ってプロットされません。また、ここに示したプロットに、自家蛍光の制限は、細胞を、対数y軸にプロット上10 2が実際に自己蛍光であり、GFP陽性細胞と誤認することができること、したがって、調整しなかった。