FIM成像和FIMtrack：两个新的工具允许高吞吐量和成本效益分析步态

注：在这里，使用FIM被提交幼虫运动的筛查自由移动条件下热刺激的影响，方便高通量分析。其他应用，如嗅觉刺激依赖运动或滚动或其他行为的高分辨率成像可能需要微妙的变化对协议，该协议可应要求提供的分析。 1.建立实验使用共（需要1小时的时间）每型约100幼虫获得统计学意义的价值观。注意：如果几个基因型需要比较并记录在不同的日子，记录每天每基因型幼虫的数量相同。 对于大多数应用，在10赫兹的参数分析记录。对于高分辨率成像应用中，如果需要改变成像速度。 第三龄幼虫，大约产卵后的120小时进行试验的跟踪。让河畔Ë的文化产生足够的幼虫在实验期间（见4.3）。 对于非刺激应用，制备含半透明的琼脂表面爬行（见第2节）。含有幼虫的刺激范围为热梯度的应用，环绕的视场与厌恶盐琼脂屏障（参见第3节）。 注：其他应用可能需要不同的表面。 请务必使用一个带恒定的环境条件（温度，光照，气流，空气湿度等 ）。 2.爬行表面处理（半透明琼脂） 注：在FIM设置的琼脂表面加入提供了潮湿的爬行表面。此外，它也提高了照明属性。 煮沸0.8％食品级琼脂在去离子纯水。对于筛选的应用做好准备400毫升。 在一个单独的33厘米X33厘米交流倾琼脂在50℃下（手 – 热）rylic-玻璃板。琼脂的表面张力，因此，温度将限定琼脂板的厚度。在50℃，2毫米厚的琼脂板被获得。煮沸后不要搅拌，倒入不断以避免气泡。准备新鲜的琼脂板为约4小时每拍摄期间。 填写标准的6毫米培养皿中，其余0.8％的琼脂溶液进行排序，清洁和幼虫，观察者实验（每基因型1盘）之前。 如果厌恶琼脂障碍是需要的应用程序，进行第3节。 修剪过的琼脂板的周界的约2cm，以获得一个平面方形表面进行记录。删除多余的琼脂。 注：大小是依赖于应用。 轻轻推滑行琼脂在有机玻璃板的边缘在冷却后直接传输琼脂板的FIM设置。 3.可选：添加厌恶琼脂屏障，克劳林志玲表面（盐琼脂） 煮沸的2.5％的食品级琼脂用3M NaCl的去离子超纯水。用于筛选在热梯度制备200毫升注：体积取决于应用程序。 切2厘米宽的缺口，先前倒周围的景色（22×22厘米）领域的爬行表面。 注意：不同的屏障的形式和视场可根据应用需要。 填写盐琼脂比跟踪表面高0.1-0.3厘米的槽口。 4.飞处理后方苍蝇在25℃培养箱中以12小时光照/黑暗周期，在65％的空气湿度调节到实验的时间标准飞食品。 对于十字架，麻醉30处女雌性果蝇和雄性8与CO 2和交叉他们130 ml培养瓶35毫升食物。 注意：一个130毫升文化小瓶35毫升食物将产生约20-30升4小时的成像范围内连吃三龄幼虫。成像和跟踪工作全部龄幼虫阶段。 滴一点水文化小瓶带动后期三龄幼虫运动和收集利用小画笔小瓶墙壁上最大的幼虫。 2-5分钟录制前，一个视频含0.8％食品级琼脂在去离子超纯水使其习惯和清理他们一个培养皿转移幼虫。 5.调整FIM成像设置的录音（非条件刺激） 如果需要调节摄像头的镜头焦距和光圈。设置曝光时间对于各摄像机。 注意：不需要实验过程中要改变这些设置。 调节照明强度由成像1幼虫，以获得良好的对比度。 保持期间记录在房间恒定的环境条件。调暗房间不打扰幼虫定向光。 6.可选：调整FIM成像设置了录音（温度逐渐刺激条件下） 注：热梯度设备是42×42×0.2cm的3铝板带亚光黑色涂料，绝缘材料上的顶位。该板被灌注从连接到两端热能转换/冷却器和油泵两个不同的电路水（参见图1B）。温度可调节从-5到+50°C。 开启前的实验热梯度设备1小时，并将其放置在设置上述允许建立所希望的温度分布和组分达到平衡。 传输与盐屏障，设置爬行表面琼脂。 将散热板在琼脂和调整板和爬行表面到2mm之间的间距（约1毫米以上的幼虫）。 建立的线性梯度至少0.8℃，从34℃（约2厘米的视场屏障）至18℃（约2厘米处的视场的相对部位的阻挡），通过调整/厘米温度的水回路到1°C和45°C的含量。 注：在金属板的不同梯度特性需要不同的温度，这需要根据经验确定。不需要在实验过程中要改变这些设置。 在第5节调整设置。 允许爬行表面在梯度平衡实验前20分钟。测试用高温计的温度梯度。 继续进行第8。 7. FIM成像（非条件刺激） 用小画笔湿轻轻收集15幼虫从习惯培养皿中，并将它们转移到跟踪表面的中心。不转让食物仍然还是太多了水（见图7.8）。 记录1 – 50幼虫上一个22厘米×22厘米跟踪区域。使用每个视频15只动物在大多数检查应用程序（统计原因，每个基因型使用至少100人）。 轻轻分开的幼虫，等待约10-20秒，直到所有的幼虫开始录制前直移动。 在每秒10帧用于非刺激条件下记录幼虫运动2分钟。使用未压缩TIF图像作为输出格式。 在录制过程中，收集幼虫从小瓶使其习惯他们的下一个视频关键：不要打扰记录幼虫光。 录制完成后，取出幼虫用大画笔，并丢弃它们按照当地的安全和法律规则。 取出幼虫后，用画笔来清洁和滋润爬行表面用超纯水去离子水。 关键：保持表面湿润在任何时候，但避免过度莫isture，它可以被看作是晕或周围的幼虫在录音滴和干扰跟踪。 8.可选：FIM成像（温度逐渐刺激条件下） 后的温度梯度的关系成立（参见第6节），将幼虫上爬行表面（见8.2） 如后准备用于即时在20秒内记录在记录软件，设置每个视频帧的数目与定义了保存通路。 略微抬起散热板，并放置幼虫在33℃2厘米从盐屏障。是指6和7作进一步的一般说明。再次降低了散热片，并开始录制，直接3-4分钟后，幼虫开始直线移动。 录制完成后，直接删除的幼虫，清洁和滋润表面。请勿触摸盐琼脂，以避免氯化钠蔓延。 关键：保持表面湿润在任何时候，但要避免过多的水分，这可以被视为光晕或周围的幼虫在录音滴和干扰跟踪。 使琼脂表面保湿1-2分钟后再次达到平衡，同时保存图像和收集新的动物准备下一个视频前。用高温计每5个视频控制温度梯度和（关于水的温度，高度和XY方向向跟踪表面）根据需要调整温度的设备。 9.跟踪幼虫移动模式注：欲了解更多详情，请参阅附带的说明书FIMTrack（补充）。对于一个程序流程图见图2。 调整跟踪参数用于使用预览选项的相应的实验。 根据照相机和视场调整每厘米像素。 调整基于所述摄像头设置每秒帧。 调整亮度阈值，以便日在所有的动物都正确地检测（反馈给出在预览）。 幼虫调整区域大小阈值。注意在预览反馈选项：单动物以黄色突出显示，碰撞幼虫以红色突出显示，每个动物的区域给出蓝色。 开始使用按钮在右下角跟踪。 注：成功跟踪之后，图像配幼虫轨道和含有所计算出的运动和姿态的功能csv文件被存储在图像目录下。 使用FIM结果查看器模块（编辑>结果查看器…），审查和手动调整的跟踪结果。如果需要的话，定义刺激区域评估数据中相对于所述刺激政权如爬行取向在相对 ​​于热梯度或距离到臭气物质的来源。对于更详细的说明，请使用手动（补充）。 数据的评估10 导入CSV文件导入Excel，MATLAB或任何其他程序进行进一步的统计分析。