Изображение на основе проточной цитометрии Методика оценки изменений в Гранулоцита функции<em> In Vitro</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
Гранулоциты представляют один компонент иммунной системы организма, которая обеспечивает первую линию обороны против вторжения антигенов. Предыдущие способы оценки функции гранулоцитов сосредоточены на способности фагоцитоза или окислительного всплеска с использованием отдельных методов, что делает его трудно установить вместе, как гранулоциты были изменены 1-4. Достижения в области проточной цитометрии привели в производстве настольных приборов, способных с высокой разрешающей способностью, многоцветной визуализации клеток в высокой пропускной образом 5. Умение сочетать изображение с традиционной проточной цитометрии представляет собой продвижение, которое обеспечивает технологическую платформу, необходимую для инноваций в рамках существующих проточной цитометрии методов и получить новую информацию о иммунной системы.
За последние десять лет, наша лаборатория, в частности, была остро сфокусировано на влиянии различных рационов питания и упражнений обработок ПаттиRNS по врожденной иммунной функции 6-9. Метод продемонстрирован в этой рукописи имеет практические последствия в рамках области клинической иммунологии. Данный способ использует возможности на основе изображений проточной цитометрии для одновременного измерения фагоцитоз бактерий частиц и окислительного. Используя этот подход, человек способен отделить активированные гранулоциты, используя переменные, предоставляемые на основе образа части анализа. Эти подмножества были идентифицированы только после оценки клеточные изображения на отдельных гранулоцитов. Кроме того Время анализа Инкубационный повлияло на переход между тремя подмножеств активации 10. Таким образом, вполне вероятно, что использование нескольких периодов инкубации может позволить способ, чтобы проверить изменение функции гранулоцитов следующей конкретной экспериментальной обработки. Цель этой рукописи было продемонстрировать способ оценки функции гранулоцитов с помощью изображения на основе проточной цитометрии для одновременного измерения фагоцитоз с oxidatIve лопнуть.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данный способ представляет собой уточнение существующих методов оценки функции гранулоцитов с помощью проточной цитометрии 1,3,4,12-14. Критические шаги этого анализа, как правило, связаны с надлежащего смешивания образца крови с bioparticles и ДНЕ. Неполное перемешивание приведет к неточным результатам. В то время как полное смешивание важно, способ смешивания должно быть нежным в природе. Предполагается, что перемешивание быть достигнуто с использованием электронного пипетки с функцией смешивания, а не вихревом смесителе. Еще одним важным шагом в анализе, чтобы всегда гарантировать, что нет никакого анализа крови загрязняют верхнюю половину пробирке. Этот остаточный крови может быть удалена с использованием стерильного хлопка наконечником аппликатора. Полное удаление важно, потому что неспособность сделать это может привести к загрязнению конечного препарата анализа с ООН-лизируют эритроциты.
До Используя этот метод надлежащего контроля компенсации должны быть добавлены для контроля SPectral перекрытие между реагентов, используемых для идентификации различных аспектов функции гранулоцитов. Для этого метода, управления компенсации включают сбор образцов крови, которые были предложены в 40 мин анализа инкубации, а затем маркировки с помощью одного маркера (т.е., кишечная палочка, DHE, и т.д.). После маркировки, единственным положительным события собраны и компенсации матрица генерируется с использованием автоматизированной мастер в программное обеспечение для анализа идей. Очень важно, чтобы при использовании этого анализа соответствующие средства контроля компенсации будут завершены, чтобы обеспечить надлежащее исполнение анализа.
Анализ осуществляется с помощью функции поисковое устройство и совместной локализации мастера, чтобы определить, что яркая интенсивность деталь лучше переменная отделить населения, а также определить, как существует много совпадений между окислительного и фагоцитоза сигналов. В частности, использование изображений на основе цитометрии при условии, способность отделить активированные гранулоциты на три подмножества. Tего подмножество пробоя определяется с использованием ярких интенсивность подробно фагоцитоза против окислительного. В дополнение к Рассматривая эти особые функции клеток, были выявлены клетки, которые выставлены оба события, в то же время в том же анатомического расположения (совместной локализации). Гранулоциты, которые упали в "высокоактивных" подмножества были только фенотип, что демонстрирует стабильный совместной локализации между фагоцитоза и окислительного всплеска. Это отождествление активированных гранулоцитов подмножеств большая область, где поиск и устранение неисправностей необходимо. Это очень важно для нового пользователя, чтобы занять время, чтобы понять рабочий процесс процесса образец в идеях и понять механику стробирования клеточной популяции с помощью компонента изображения. Другие модификации, которые пользователь может запросить, чтобы включать в себя выбор альтернативных или дополнительных раза анализа инкубации. В настоящее время метод предполагает использование длительности 10-40 мин; Однако, в зависимости от экспериментальной модели, где этот методдля использования, это может быть необходимо, чтобы выбрать больше опробования длительности. Такая модификация должны быть оценены на индивидуальной основе.
Кроме того было установлено, что продолжительность инкубации анализа оказывает существенное влияние на внешний вид трех активированных подмножеств. Подход, описанный в настоящем докладе, представляет собой продолжение того, что информация может быть получена ранее в отношении гранулоцитов функции 3,4,13,15. Другие лаборатории продемонстрировали важность оценки изменения в функции гранулоцитов в рамках комплексной оценки иммунитета и болезни 15-17. Несмотря на потенциал этого анализа не без ограничений. Одним из главных ограничений является стоимость и время спроса, связанного с высоким образца обработки пропускной способности. Когда Дизайн исследования требует большого количества образцов в данный день, это может быть трудно обрабатывать. Обработка упорядочить с помощью электронных пипец, и фармацевтов,но они, как правило, дорогие и не всегда доступны в каждой лаборатории.
Наша область исследований фокусируется на исследовании того, как физические упражнения и диетические привычки влияют на здоровье иммунной системы и функции 6,8-10,18-20. Такие цели имеют значительные практические последствия для самых различных областей человеческого здоровья. Помимо изучения упражнений и питания эффектов метод фагоцитоз показано в этой рукописи могут быть полезны и в других областях клинической иммунологии, где мониторинг функции фагоцитоза имеет решающее значение для результатов лечения. Настоящий анализ является первым из многих, что иммунологические анализы с потенциалом, чтобы быть повторно изобретен воспользоваться преимуществами уникальной информации изображающего, что может быть может из потока на основе образа цитометра.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker’s yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker’s Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
