이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em> 체외</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
과립구는 침입 항원에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공하는 인체의 선천성 면역 시스템의 하나의 구성 요소를 나타냅니다. 과립구 기능을 평가하기위한 이전 방법은 과립구가 1-4을 어떻게 변화 해 왔는지 어려운 집단적으로 확인 할 수있게 별도의 방법을 사용하여 탐식 능력 또는 산화 버스트에 초점을 맞추었다. 흐름의 분야에서의 발전은 계측법 고 스루풋으로 5 세포의 고해상도 멀티 컬러 촬상 가능한 탁상 악기의 생산에 성공. 기존의 흐름과 함께 영상을 결합하는 능력은 세포 계측법 방법 세포 계측법 기존의 흐름 내에서 혁신과 면역 체계에 대한 새로운 정보를 추출하는 데 필요한 기술 플랫폼을 제공하는 진보를 나타냅니다.
지난 10 년 동안, 다른 사람의 사이에서 우리의 실험실은, 날카롭게 다양한 영양 및 운동 치료 patte의 효과에 초점을 맞추고있다선천성 면역 기능 6-9 RNS. 이 원고의 입증 방법은 임상 면역학 분야 내에서 실제적인 의미를 가지고있다. 본 방법은 동시에 세균 입자 및 산화 버스트의 식균 작용을 측정 할 수있는 이미지 기반의 유세포 전력을 활용. 이 방법을 사용하여, 하나의 화상 해석 계 부분에 의해 제공되는 변수를 사용하여 활성화 과립구를 분리 할 수있다. 이러한 개별 서브 세트들은 과립구 세포에서 이미지를 평가 한 후에 만 식별 할 수 있었다. 또한 분석 배양 시간은 세 개의 활성화 서브 세트 (10) 사이의 전이에 영향을 미쳤다. 따라서, 다수의 인큐베이션 시간의 사용 방법은 다음과 같은 특정 실험 치료 과립구 함수의 변화를 테스트 할 수 있다는 그럴듯. 이 원고의 목적은 식균 작용과 동시에 oxidat을 측정하는 영상 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 평가 함수 과립구의 방법을 설명했다필자는 버스트.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 발명의 방법은 1,3,4,12-14 유동 세포 계측법을 사용하여 과립구 기능의 평가를위한 기존의 방법의 구체화를 나타냅니다. 이 분석의 중요한 단계는 bioparticles DHE과 함께 혈액 샘플의 적절한 혼합에 관련되는 경향이있다. 불완전한 혼합은 부정확 한 결과가 발생합니다. 완전한 혼합이 중요하지만, 혼합 방법은 자연에서 완만해야한다. 이 혼합 기능보다는 볼텍스 믹서와 전자 피펫을 혼합하여 이루어질 수 있음을 제안한다. 분석에서의 또 다른 중요한 단계는 항상 분석 튜브의 상부 절반을 오염 혈흔가 없도록하는 것이다. 이 잔여 혈액을 멸균 면봉을 사용하여 제거 할 수있다. 오류가 미 용해 적혈구 제제 최종 분석을 오염시킬 수 있기 때문에 그렇게 완전한 제거가 중요하다.
이 방법에게 적절한 보상 컨트롤을 사용하기 전에이 SP의 제어를 추가해야과립구 함수의 다양한 양태를 식별하는 데 사용되는 시약 사이 ectral 오버랩. 이 방법의 경우, 보상 제어가 40 분 검정 인큐베이션을 제안하고 단일 마커로 라벨링 된 혈액 샘플을 수집 포함 (예, E. 콜리, DHE 등). 표지 한 후, 하나의 양의 이벤트가 수집되고 보정 행렬 IDEAS 분석 소프트웨어에서 자동 마법사를 사용하여 생성된다. 이것은 상기 분석이 사용될 경우, 적절한 보상 제어가 적절한 분석 성능을 보장하기 위해 완성하는 것이 중요하다.
분석 밝은 상세 강도가 집단을 구분하는 가장 좋은 변수임을 확인하고 또한 많은 중복 산화 버스트와 식균 작용 신호 사이에 존재하는 방법을 식별하는 기능을 찾기 및 공동 현지화 마법사를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 구체적으로는, 이미지 기반 계측법의 사용은 세 개의 서브 세트들로 과립구 활성화를 분리하는 기능을 제공했다. 티자신의 일부 고장은 산화 버스트 대 식세포의 밝은 세부 강도를 사용하여 측정 하였다. 단수 이들 세포의 기능을 검사하는 이외에도, 같은 해부학 적 위치 (CO 지방화)에서 동시에 이벤트를 나타내 세포 확인되었다. "고 활성"부분 집합으로 떨어졌다 과립구는 식균 작용과 산화 버스트 사이의 일관된 공동 현지화를 입증하는 유일한 표현형했다. 활성화 과립구 부분 집합이 식별 문제 해결이 필요한 가장 큰 지역이다. 사용자가 새로운 아이디어 샘플 프로세스 흐름을 이해하기 위해 시간이 걸릴 및 이미징 요소를 사용하여 세포 집단을 게이팅 메커니즘을 이해하는 것이 매우 중요하다. 사용자가 확인하고자 수있는 다른 수정 대체 또는 추가 분석 배양 시간의 선택을 포함한다. 현재의 방법은 10 ~ 40 분의 지속 시간의 사용을 제안한다; 그러나, 실험 모델에 따라,이 방법은 어디사용하기 위해서는, 더 긴 지속 시간 분석을 선택해야 할 것이다. 이러한 변경은 개별적으로 평가 될 필요가있다.
또한 그것은 검정 인큐베이션 기간은 세 개의 활성화 된 서브 세트의 외관에 현저한 효과가 있다고 판단 하였다. 이 보고서에 기술 된 방법은 이전에 과립구 기능 3,4,13,15에 대해 얻을 수있는 정보의 확장을 나타냅니다. 다른 실험실 면역 질환의 15-17 종합 평가의 일부로서 과립구 함수의 변화를 평가하는 것의 중요성을 보여 주었다. 이 분석의 잠재력에도 불구하고 한계가없는 것은 아니다. 주요한 제한 사항 중 하나는 높은 시료 처리 처리와 관련된 비용과 시간을 요구한다. 연구 설계가 주어진 날에 많은 수의 샘플을 필요로하는 경우, 이러한 처리는 어려울 수있다. 처리 전자 피펫 및 디스펜서를 이용하여 간소화,그러나 이들은 비싼 경향이 모든 실험실에서 반드시 사용할 수 없습니다.
연구의 우리의 영역은 운동과식이 습관이 면역 체계의 건강에 영향을주고 6,8-10,18-20를 작동 방법에 대한 연구에 초점을 맞추고있다. 이러한 목적은 인간의 건강의 다양한 분야에 대한 상당한 실질적인 의미를 가지고있다. 탐식 기능의 모니터링이 치료 결과에 중요 여기서 운동 영양 효과 이외에도 본 연구에서 입증 원고 탐식 방법은 임상 면역학의 다른 분야에서 유용 할 수있다. 본 분석은 가능성이있는 면역 학적 분석이 계측기 이미지 기반 흐름에서 할 수 할 수 있습니다 독특한 영상 정보의 장점을 취함으로써 다시 발명 할 것이 많은 사람들의 첫 번째입니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
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