Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em> In-vitro-</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
Granulozyten stellen einen Bestandteil des körpereigenen angeborenen Immunsystems, die die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Antigene zur Verfügung stellt. Frühere Verfahren zur Beurteilung Granulozytenfunktion fokussiert auf die Phagozytose Kapazität oder oxidativen Burst mit separaten Methoden, so dass es schwierig ist, festzustellen, wie kollektiv Granulozyten 1-4 verändert. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflußzytometrie in der Herstellung von Tischgeräten in der Lage, hochauflösende, Mehrfarbenbilder von Zellen in einem Hochdurch Weise 5 geführt. Die Fähigkeit zur Bildgebung mit traditionellen Flow kombinieren Zytometrie stellt eine Weiterentwicklung, die die technologische Plattform benötigt, um im Rahmen der bestehenden Flusszytometrie Methoden innovativ und extrahieren Sie neue Informationen über das Immunsystem bietet.
In den letzten zehn Jahren hat unser Labor unter anderem stark von der Wirkung von verschiedenen Ernährungs- und Bewegungs Behandlungen Patte fokussiertrns auf angeborene Immunfunktion 6-9. Die in dieser Handschrift zeigte Methode hat praktische Auswirkungen im Bereich der klinischen Immunologie. Das vorliegende Verfahren nutzt die Leistung von bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose von Bakterien und Partikeln oxidativen Burst. Mit dieser Vorgehensweise ist man in der Lage aktivierten Granulozyten mit Variablen durch die bildbasierte Teil der Analyse bereitgestellt trennen. Diese Teilmengen nur erkennbar, nachdem die Beurteilung der Zellbilder auf den einzelnen Granulozyten. Weitere Assays Inkubationszeit betroffen den Übergang zwischen den drei Untergruppen Aktivierungs 10. Somit ist es plausibel, dass die Verwendung von mehreren Inkubationszeiten erlauben ein Verfahren, um die Änderung in Granulozytenfunktion nach einem spezifischen experimentellen Behandlung zu testen. Der Zweck dieses Manuskripts wurde die Bereitstellung eines Verfahrens zur Beurteilung Granulozytenfunktion mithilfe bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose mit oxidat demonstrierenive platzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Verfahren stellt eine Verfeinerung der bestehenden Methoden zur Bewertung der Granulozyten-Funktion mit Hilfe der Durchflusszytometrie 1,3,4,12-14. Die kritischen Schritte des Assays sind in der Regel auf das richtige Mischen der Blutprobe mit den Biopartikeln und DHE hängen. Unvollständige Mischung wird zu ungenauen Ergebnissen führen. Während eine vollständige Durchmischung kritisch ist, sollte die Mischmethode sanftes Natur sein. Es wird vorgeschlagen, dass das Mischen unter Verwendung einer elektronischen Pipette mit einer Mischfunktion, anstatt einem Wirbelmischer durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt im Assay ist, immer sicher, dass kein Blut Verunreinigung der oberen Hälfte der Teströhrchen. Das Restblut kann mit einem sterilen Wattestäbchen entfernt werden. Die vollständige Entfernung ist wichtig, weil dies versäumt, so kann die endgültige Testvorbereitung mit nicht lysierten roten Blutkörperchen verunreinigen.
Vor der Verwendung dieser Methode eine angemessene Entschädigung Kontrollen sollten hinzugefügt, um sp steuernectral Überlappung zwischen den verwendet, um die verschiedenen Aspekte der Granulozytenfunktion identifizieren Reagenzien. Für diese Methode Entschädigung Kontrollen umfassen sammeln Blutproben, die die 40 min Inkubation Assay vorgeschlagen haben und die Kennzeichnung mit einem einzigen Marker (dh E. coli, DHE, etc.). Nach der Markierung werden einzelne positive Ereignisse gesammelt und einer Kompensationsmatrix wird mit Hilfe eines automatisierten Assistenten in der IDEEN-Analyse-Software generiert. Es ist kritisch, dass, wenn dieser Test verwendet wird, geeignete Kompensationssteuerungen abgeschlossen sind, um eine ordnungsgemäße Testleistung zu gewährleisten.
Die Analyse wird mit Hilfe der Funktion Finder und Co-Lokalisation Assistenten zu erkennen, dass helle Detail Intensität ist die beste Variable, um die Bevölkerung zu trennen und zu identifizieren, wie viel Überschneidung zwischen oxidativen Burst und Phagozytose Signale vorhanden erreicht. Insbesondere die Verwendung von bildbasierten Zytometrie vorgesehen die Fähigkeit aktivierten Granulozyten in drei Teilmengen zu trennen. Tseine Teilmenge Aufteilung wurde mit hellen Detail Intensität der Phagozytose gegen oxidativen Burst bestimmt. Neben der Untersuchung dieser singulären Zellfunktionen wurden die Zellen, die sowohl Veranstaltungen zur gleichen Zeit in der gleichen anatomischen Lage (Co-Lokalisation) zeigten identifiziert. Granulozyten, die in die "high-aktiv" Untergruppe fiel das einzige Phänotyp, die im Einklang Kolokalisation zwischen Phagozytose und oxidativen Burst demonstriert. Diese Identifizierung aktivierter Granulozyten-Untergruppen ist der größte Bereich, in dem Problembehandlung erforderlich ist. Es ist sehr wichtig für ein neuer Benutzer sich Zeit zu nehmen, um die Probe Prozess-Workflow in IDEAS zu verstehen und die Mechanik der Anschnitt die Zellpopulationen mit dem bildgebenden Komponente zu verstehen. Andere Änderungen, die ein Benutzer kann versuchen, zu machen sind die Auswahl der anderen oder einen zusätzlichen Test Inkubationszeiten. Das gegenwärtige Verfahren schlägt die Verwendung von Zeitdauern von 10-40 min; jedoch in Abhängigkeit von dem experimentellen Modell, wenn dieses Verfahrenverwendet werden soll, kann es notwendig mehr Assay Dauern auszuwählen. Eine solche Veränderung würde müssen individuell bewertet werden.
Ferner wurde bestimmt, daß die Dauer der Inkubation werden eine signifikante Wirkung auf das Aussehen der drei Untergruppen aktiviert. Die in diesem Bericht beschriebenen Ansatz stellt eine Erweiterung, welche Informationen bereits erhalten werden konnten bezüglich Granulozytenfunktion 3,4,13,15. Andere Labors haben die Bedeutung der Beurteilung von Veränderungen in Granulozytenfunktion als Teil einer umfassenden Bewertung der Immunität und Krankheit 15 bis 17 gezeigt. Trotz des Potentials dieses Assays ist es nicht ohne Einschränkungen. Eine der Haupteinschränkungen mit hohem Probendurchsatz assoziiert Kosten und Zeitbedarf. Wenn ein Studiendesign erfordert eine große Anzahl von Proben in einem gegebenen Tag, können diese schwierig zu verarbeiten sein. Die Verarbeitung wird durch den Einsatz von elektronischen Pipetten und Dispenser gestrafft,aber diese neigen dazu, teuer zu sein und sind nicht notwendigerweise in jedem Labor.
Unsere Forschungsbereich konzentriert sich auf eine Studie, wie Bewegung und Ernährungsgewohnheiten beeinflussen die Gesundheit des Immunsystems und Funktion 6,8-10,18-20. Diese Ziele haben signifikante praktische Bedeutung für eine Vielzahl von Bereichen der menschlichen Gesundheit. Über die Untersuchung der Bewegung und Futterverwertung der Phagozytose Verfahren in diesem Manuskript konnte gezeigt werden, die in anderen Bereichen der klinischen Immunologie, wo die Überwachung der Phagozytose Funktion ist entscheidend für die Behandlungsergebnisse. Die vorliegende Test ist der erste von vielen, dass immunologische Tests mit dem Potenzial, indem sie Vorteile der einzigartigen Bildinformationen, die von einer bildbasierten Durchflusszytometer werden können, können neu erfunden werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
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