Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer<em> In Vitro</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
Granulocyten vormen een onderdeel van het lichaam het aangeboren immuunsysteem, die de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende antigenen biedt. Vorige methoden voor de beoordeling van granulocyten functie gericht op fagocytosecapaciteit of oxidatieve burst het gebruik van afzonderlijke methoden, waardoor het moeilijk is om gezamenlijk na te gaan hoe granulocyten zijn veranderd 1-4. Vooruitgang op het gebied van flowcytometrie hebben geleid tot de productie van stationaire apparaten voor het hoge-resolutie, multi-color beeldvorming van cellen in een high throughput wijze 5. De mogelijkheid om beeldvorming te combineren met traditionele flowcytometrie vertegenwoordigt een vooruitgang dat de technologische platform nodig om te innoveren binnen bestaande flowcytometrie methoden en pak nieuwe informatie over het immuunsysteem zorgt.
In de afgelopen tien jaar heeft ons laboratorium, onder anderen, is scherp gericht op het effect van verschillende voedings- en oefening behandelingen patterns op aangeboren immuunsysteem 6-9. De werkwijze aangetoond in dit manuscript heeft praktische implicaties op het gebied van klinische immunologie. De huidige methode maakt gebruik van de kracht van beeld-gebaseerde flowcytometrie om gelijktijdig meten van fagocytose van bacteriële deeltjes en oxidatieve burst. Met deze aanpak, is men in staat om geactiveerde granulocyten gebruik van variabelen die door de beeld-gebaseerde deel van de analyse te scheiden. Deze subgroepen waren slechts herkenbaar na de beoordeling van de beelden van de cel op het individu granulocyten. Verdere analyse incubatietijd beïnvloed de overgang tussen de drie activatie subsets 10. Aldus is het aannemelijk dat het gebruik van meerdere incubatietijd mag een methode om de verandering in granulocyten functie na een bepaalde experimentele behandeling getest. Het doel van dit manuscript was om een methode voor het beoordelen van granulocyten functie aan te tonen met behulp van image-based flowcytometrie om gelijktijdig meten van fagocytose met oxidative barsten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige werkwijze is een verfijning van bestaande methoden voor de beoordeling van granulocyten functie met behulp van flowcytometrie 1,3,4,12-14. De kritische stappen van deze test vaak gerelateerd goede menging van het bloedmonster met de bioparticles en DHE. Onvolledige menging zal leiden tot onnauwkeurige resultaten. Terwijl volledige menging kritisch moet de mengmethode zachte aard zijn. Voorgesteld wordt mengen worden bereikt met een elektronische pipet met een mengfunctie plaats van een vortex mixer. Een kritische stap bij de bepaling is om altijd zorgen dat er geen bloed besmetting van de bovenste helft van de testbuis. Dit resterende bloed kan worden verwijderd met behulp van een steriel wattenstaafje. Volledige verwijdering is belangrijk, omdat het niet om dit te doen kan de test voorbereiding met-un gelyseerde rode bloedcellen besmetten.
Voorafgaand aan het gebruik van deze methode een passende compensatie controles moeten worden toegevoegd om te controleren voor spectral overlap tussen de reagentia gebruikt om de verschillende aspecten van granulocyten functie identificeren. Voor deze methode compensatie controles omvatten verzamelen bloedmonsters die zijn voorgesteld de 40 min incubatie assay en vervolgens labelen met een marker (bijv E. coli, DHE, etc.). Na etikettering, worden enkele positieve gebeurtenissen verzameld en een vergoeding matrix wordt gegenereerd met behulp van een geautomatiseerd tovenaar in de IDEAS analyse software. Het is cruciaal dat als deze test wordt gebruikt, geschikte compensatie controles worden voltooid om goede test prestaties.
Analyse wordt uitgevoerd met behulp van de functie finder en co-lokalisatie wizards te identificeren die heldere details intensiteit is de beste variabele aan de bevolking te scheiden en ook bepalen hoe veel overlap bestaat tussen oxidatieve burst en fagocytose signalen. Met name het gebruik van beeldgebaseerde cytometrie ontvangen het vermogen geactiveerde granulocyten scheiden in drie deelverzamelingen. Tzijn opsplitsing deelverzameling werd bepaald met behulp van heldere details intensiteit van fagocytose vs. oxidatieve burst. Naast het onderzoek van deze bijzondere celfuncties, werden cellen die beide gebeurtenissen vertoonden tegelijk in dezelfde anatomische plaats (co-lokalisatie) geïdentificeerd. Granulocyten dat viel in de "high-actief" deelverzameling waren de enige fenotype die consistent zijn co-localisatie tussen fagocytose en oxidatieve burst aangetoond. Deze identificatie van geactiveerde granulocyten subsets is het grootste gebied waar problemen nodig. Het is zeer belangrijk voor een nieuwe gebruiker tijd om het monster procesworkflow in IDEEËN begrijpen en de mechanica van gating de celpopulaties met de beeldvormende component begrijpen. Andere wijzigingen die een gebruiker kunnen proberen te maken onder andere de selectie van alternatieve of aanvullende test incubatietijd. De huidige methode suggereert het gebruik van een duur van 10-40 minuten; echter, afhankelijk van het experimentele model waarbij deze werkwijzete gebruiken, kan het nodig langere looptijden assay selecteren zijn. Een dergelijke wijziging zou moeten worden beoordeeld op individuele basis.
Verder werd vastgesteld dat de duur van de test incubatie heeft een significant effect op het uiterlijk van de drie geactiveerde subsets. De in dit rapport beschreven aanpak betekent een uitbreiding van de informatie die voorheen niet konden worden verkregen met betrekking tot granulocyten functie 3,4,13,15. Andere laboratoria hebben het belang van de beoordeling van veranderingen in de granulocyten functie als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van de immuniteit en de ziekte van 15-17 aangetoond. Ondanks het potentieel van deze test is niet zonder beperkingen. Een van de belangrijkste beperkingen kosteneffectief en tijd vraag geassocieerd met veel monsters worden verwerkt. Bij een studie ontwerp vereist een groot aantal monsters in een bepaalde dag, kan dit moeilijk te verwerken. Verwerking wordt gestroomlijnd door het gebruik van elektronische pipetten en dispensers,maar deze hebben de neiging duur te zijn en zijn per definitie niet beschikbaar in elk laboratorium.
Ons gebied van onderzoek richt zich op een studie van hoe lichaamsbeweging en eetgewoonten beïnvloeden het immuunsysteem gezondheid en functioneren 6,8-10,18-20. Dergelijke doelstellingen hebben belangrijke praktische gevolgen voor verschillende gebieden van de menselijke gezondheid. Voorbij de studie bewegen en nutritionele effecten de fagocytose methode aangetoond in dit manuscript bruikbaar in andere gebieden van klinische immunologie kunnen zijn bij het opmaken van fagocytose functie is kritisch voor behandelingsresultaten. De onderhavige bepalingsmethode is de eerste van vele die immunologische assays met mogelijk opnieuw uitgevonden door middel voordelen van de unieke imaging informatie van een beeldgebaseerde flowcytometer kan worden kan.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker’s yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker’s Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
