基于图像的流式细胞仪技术来评估变化粒细胞功能<em>在体外</em

注：此方法描述的所有血液采集程序均按照赫尔辛基宣言进行，批准UNT机构审查委员会（IRB）的人类受试者。所有受试者得到的采血，将其用于本发明的方法，以确保它们的正常体重明显健康，和无病的书面同意。 1.试剂来源及制品使用CD66b-APC（克隆＃G10F5; DF = 1：50）和CD45-APCeFluor780（克隆＃2D1; DF = 1：50），用于该测定。 注意：在此之前的研究中，CD45和CD66b的抗体滴度，以确定最佳稀释，从其它白细胞清楚地分辨粒（CD45 + / 66B +）（CD45 + / 66b-）11。在加入稀释的抗体的染色在管的最终稀释度为875。 购买和解冻的股票S.金黄色葡萄球菌生物粒子标记盒pHrodo红色染料。暂停在1米的浓度克无菌PBS每毫升生物粒子的。等分试样稀释生物粒子和储存冷冻在-20℃直至在测定中使用。 溶解二氢乙（DHE），它被转换为荧光的溴化乙锭中的氧自由基（ 即氧化突发）的存在下，在DMSO中，10微克/毫升的最终浓度。 混合N-乙基马来酰亚胺（用于防止附加吞噬下列指定的测定温育持续时间）用无菌PBS以2步稀释200毫克/毫升和17.5毫克/毫升分别。在测定中，使用15mM的终浓度。当解冻N-乙基马来酰亚胺，使用37℃的热块，作为N-乙基马来酰亚胺不会留在溶液中。 最终固定步骤后，用7AAD染色的核DNA。然后加入稀库存7AAD 1:10的用无菌PBS。 2.采血要求受试者在实验室下面的O / N高速（> 8小时），并abstenti到达从身体活动（> 12小时）。 清洗用酒精消毒片皮肤后，将无菌采血针到外围手臂静脉。 采集血液注入真空管被商业化充满了肝素钠。 收集后，取粘性绷带被摄对象的手臂。 反转血液试管混合10次，然后放在一个摇杆直至分析。 3.吞噬分析技术解冻葡萄球菌生物粒子（RT）下，DHE（RT），和N-乙基马来酰亚胺（37℃）。 加入20升生物粒子金黄色葡萄球菌的4个人1.2毫升管在无菌罩工作时。 添加40升DHE的含有该生物粒子每个管。 轻轻拍打在板凳面管收集试剂的试管底部。 添加100μL的混合全血到已填充有生物粒子和DHE每个管。 擦拭管的内侧边缘与一棉签以除去任何污染的血液。 混合血液和试剂与电子移液器设置为混合血液和试剂的血液加入后三个周期。 将试管在冰桶和盖由轻保护。 孵育测定管10，20和40分钟。先从40分钟管，以确保所有试管在同一时间完成。 解冻N-乙基马来酰亚胺在37℃水浴珠。 吸管15升N-乙基马来酰亚胺（上面1.4中描述）到每个测试管的，孵育30分钟。 吸管10升CD66b-APC和10μlCD45-APCeFluor780稀释抗体（上述1.1中所述）的，孵育60分钟。 吸取750升的WBC修复/ RBC裂解液到每个测试管，孵育60分钟。 离心（10分钟，400×g离心）测定管，收集细胞沉淀。 真空吸出WBC裂解/ RBC修复方案，留下的残余FLUID体积（100μL）中的细胞沉淀。 吸管10μL的稀释7AAD溶液（上述1.5中所述）和50升的PBS到每个测试管。 添加的校准珠（〜25L）向每个测试管，代替帽一滴上测定管，包裹管中的箔片，并在冰箱中的地方。 装载样品管插入基于图像流式细胞仪和收集至少使用预先定义的参数3000粒事件：自动进样器，蓝色（488纳米; 60毫瓦），红（640纳米; 10​​0 NW），SSC（785纳米; 8.5毫瓦）的激光器（ 图1）。 图1.采集方法和模板。被收购上的图像为基础的流式细胞仪（A）样品。在采集过程中，散点图的亮场宽高比与CD66b-APC生成从尖刺校准珠全光照分离粒克INSPIRE诉100.2.292.0软件（B）。 ，红色（640纳米，100 NW），SSC（785纳米; 8.5毫瓦）的激光器;使用自动进样器，蓝色（60毫瓦488纳米）分别获得每个样品最少5000粒。请注意，一些直方图是收购来监控激光设置和数据等方面收集时在座。所有这些直方图是可选的，只有在实验室标准操作程序要求他们作为质量控制的需要。 请点击此处查看该图的放大版本。 4.样品采集与分析使用IDEAS软件的自动化软件补偿向导申请补偿矩阵原始图像文件（RIF），并创建补偿成像文件（CIF）。 加载单独的CIF文件IDEAS软件，并生成以下地块以确定粒子集： </LI> 建立初始门来识别被认为是在焦点使用直方图对明场梯度的RMS（ 图2A）的细胞。做出此判断，使用无刺激控制作为参考标准每个病人的样本。 使用辅助图来从碎屑和双峰分离单细胞使用的明场纵横比（单元高度与宽度的比值）与明视场区域（ 图2B）的点积。做出此判断，使用无刺激控制作为参考标准每个病人的样本。 一旦细胞干净人口已确定，建立的CD45与CD66b（ 图2C）的一个点图来正确识别粒（CD45 + / 66B +）。共创美好的细节强度S.的女儿图 （ 图3） 金黄色葡萄球菌 （x轴）与明亮的细节强度为氧化爆发（DHE，y轴）来识别激活的粒细胞的子集。收集BR在通道1和9飞行场图像，在通道2生物粒子，DHE在第4频道，7AAD在5频道，CD66b在11频道，和CD45在12频道。 图2.分析模板，这个数字的系列被产生，以确定细胞分别在聚焦（A）中的曲线，单细胞（B），粒细胞（C）。附加地块被用来确定激活的粒与无活性的粒细胞的三个子集。获取的图像文件的所有分析使用IDEAS第6节软件完成。 请点击此处查看该图的放大版本。