Floral-Dip transformación de lino (<em> Linum usitatissimum</em>) Para generar transgénicos progenies con una alta tasa de Transformación

1. Crecimiento de los Vegetales 6 semanas antes de la inmersión, llenar macetas de 5 pulgadas con tierra y sembrar las semillas de lino ¼ de pulgada de profundidad en el suelo (4 semillas por maceta). Asegúrese de afirmar el suelo sobre las semillas. Riegue las plantas regularmente y mantenerlos en la luz del día largo (14 horas de luz y 10 horas de oscuridad). Compruebe plantas regularmente para inflorescencias primarios (grupos de órganos flores '). Las plantas están listas para la transformación cuando los brotes son visibles y sólo se han formado en la inflorescencia (Figura 1 y 2). Para ver los brotes, cortar las hojas alrededor de él, si es necesario. NOTA: El uso de la mejor etapa de la flor es crítica y se detalla en la Discusión. Utilice la rama principal de la planta para el tratamiento experimental, ya que produce más flores que los manojos secundarios. Utilice las ramas laterales, ya sea como controles (que no debe de cruce) u otros tratamientos experimentales. Como alternativa, utilice los principales y secundarios ramas de lamisma planta para el tratamiento experimental y el uso de otra planta como un control o para otros tratamientos experimentales. Utilice las etiquetas para marcar las distintas ramas y flores individuales con la fecha y el tipo de tratamiento. 2. Clonación y transformación para Escherichia coli (E. coli) Células Clonar el fragmento / gen de interés en el sitio de clonación múltiple de un vector binario de la planta que alberga el ADN-T. Realice la clonación en un paso o dos pasos. Directamente clonar insertos pequeños en este protocolo (~ 500 pb) en el vector binario planta. En este protocolo, utilizar el vector binario de la planta (PRI909). De lo contrario, utilice otros vectores binarios de plantas en una estrategia similar. Alternativamente, clonar grandes insertos (≥6.5 kb) en dos pasos: primero usando un kit de clonación comercial general (no específica de la planta), entonces subclonar en el vector binario de la planta. Configurar una reac PCRción para amplificar el gen de interés. Diseño de los cebadores con sitios de restricción en el extremo 5 '(de acuerdo con el sitio de clonación múltiple del vector binario de la planta en uso). Realizar una PCR estándar usando ADN genómico de lino con las siguientes condiciones de ciclo: un agarre inicial de 24 ° C, a continuación, 2 min a 94 ° C, seguido por 30 ciclos de 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, y 72 ° C durante 2 min. Realice una etapa de extensión final a 72 ° C durante 5 min seguido de una pausa indefinida a 4 ° C. Productos de PCR separados en 1% de Tris / borato / EDTA (TBE) en gel de agarosa, corren el gel a 100 V durante 1 hora. Purificar los productos a partir del gel y cuantificar a través de Nanodrop. Configure la mezcla de ligación para clonar el producto de la PCR en el vector de clonación comercial. Siga el protocolo del fabricante. Transformar la mezcla de ligación en E. químicamente competentes células de E. coli como sigue. Añadir 2 l de la mezcla de ligación en un vial de chE. punto de vista emic competente células de E. coli. Incubar en hielo durante 30 min. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C (Heat tiempo de choque y la temperatura depende del tipo de células utilizadas). Incubar en hielo y añadir 250 l de caldo de RT súper óptima con represión catabólica (SOC) medio. Tapar el tubo y se incuba en un agitador orbital a 200 rpm a 37 ° C durante una hora. Spread 10-50 l de cada transformación sobre una placa precalentada LB (precalentado a 37 ° C) + antibiótico selectivo apropiado (determinar el antibiótico selectivo basado en el tipo de vector de clonación comercial utilizado). Incubar las placas a 37 ° CO / N. Escoja ~ 10 colonias para la purificación del plásmido prep mini, utilizando un kit comercial. Purificación Mini plásmido preparación se realiza generalmente de la siguiente manera. NOTA: Los nombres de amortiguamiento son específicas del kit comercial utilizado, pero sus funciones generales son similares. Inocular las colonias individuales en 2- 5 ml de LB medio que contiene el antibiótico selectivo apropiado (determinado en base al tipo de vector comercial utilizado). Incubar durante aproximadamente 8 horas a 37 ° C con agitación vigorosa (~ 300 rpm). Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min. Resuspender el sedimento en el tampón de resuspensión 250 l. Mezclar y agitar para dispersar completamente el pellet. Lisar las células bacterianas mediante la adición de 250 l de tampón de lisis, mezclar bien invirtiendo los tubos 4 – 6 veces. Neutralizar el lisado en el tampón de neutralización e invertir 4 – 6 veces para mezclar. Centrifugar durante 10 min a ~ 17.900 xg en una microcentrífuga de mesa. La transferencia de los sobrenadantes de la etapa anterior a una columna de centrifugación. Centrifugar de nuevo a ~ 17.900 xg durante 30 – 60 seg. Lavar la columna de centrifugación añadiendo tampón de lavado 0,75 ml y centrifugar durante 30 – 60 seg. Deseche el flujo directo. Se centrifuga durante 1 min a remohe tampón de lavado. Coloque la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. Para eluir el ADN, añadir agua 50 l para el centro de cada columna. Deje reposar durante 1 minuto, y centrifugar durante 1 min. 3. Analizar el Purificada plásmidos para la Presencia de inserción Digestión de restricción Configurar una digestión de restricción para determinar la presencia del inserto mediante la digestión del plásmido con las enzimas de restricción utilizadas para clonar el inserto. Una restricción doble típico digerir reacción de la siguiente manera: 1 g de plásmido purificado, 1 l de cada enzimas de restricción, 2 l de 10x tampón de digestión de restricción + 2 l BSA (si es aplicable), X l de agua (hasta un total de 20 l) Mezclar suavemente y se incuba a temperatura recomendada (varía de una enzima a otra). Analizar la digestión de restricción reacción el 1% TBE gel de agarosa, correr a 100 V durante 1 hora y buscar la deserción de tamaño apropiado. Análisis de PCR: Configurar una PCR con el plásmido purificado, usando cebadores de la región de vector comercial para amplificar el interior de la inserción o la unión entre el vector y el inserto. Cebadores comunes son M13 adelante y atrás primers y T3 / T7. En este protocolo, utilice las siguientes condiciones de ciclo de PCR: un mantenimiento inicial de 24 ° C, a continuación, 2 min a 94 ° C, seguido de 18 ciclos a 98 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 15 segundos y 72 ° C durante 2 min. Realice una etapa de extensión final a 72 ° C durante 5 min seguido de una pausa indefinida a 4 ° C. Productos de PCR de carga en una TBE gel de agarosa al 1% y una duración de 100 a 120 V durante 1 hora. Secuenciación: Enviar el plásmido purificado a una instalación de secuenciación comercial para analizar y confirmar la presencia del inserto. Una vez obtenida la construcción correcta, lo utilizan para la segunda etapa de la clonación (en la planta de vector binario). NOTA: Los pasos 2.3 a 3.3puede ser eliminado si la clonación se completa en un solo paso. 4. Clonación en la Planta vector binario (PRI909) y E. coli Transformación Establecer una restricción doble digerir reacciones para linealizar el vector binario de la planta y aislar el inserto clonado previamente usando los mismos sitios de enzimas de restricción que se añadieron a los cebadores (paso 2.2). Analizar las digestiones de restricción mediante electroforesis en gel, correr a 100 V durante 1 – 2 horas. Cortar la pieza de inserción y la planta de vector binario linealizado a partir del gel. Utilice un kit comercial para purificar los productos de gel. Consulte el manual del fabricante. Configurar una reacción de ligación para ligar el inserto en el vector binario planta. El inserto de vector relación depende del tamaño del inserto y el vector binario de la planta. En este protocolo la inserción LIS1 fue de 6,5 kb y la planta vector binario fue de 9 kb. Por lo tanto, utilice un 1: 2 de inserción a la proporción de vectores. <li> Repita los pasos 2,4 a 3 para la transformación bacteriana, la purificación del plásmido y análisis. Una vez que se obtiene la construcción correcta (insert + planta vector binario), proceder a la electroporación en el paso 5. 5. electroporación en células de Agrobacterium tumefaciens competentes eléctricamente Descongelar un vial de Agrobacterium tumefaciens células eléctricamente competentes en hielo. Añadir 1 ng de ADN de plásmido vector binario para 20 l de células competentes, en hielo, y mezclar suavemente. Enfriar una cubeta de electroporación de 0,1 cm en hielo. Transfiera la mezcla de células / ADN competente para las cubetas de electroporación, y toque para recoger la mezcla en la parte inferior. Poner la cubeta en la máquina electroporador y el pulso (condiciones de tensión y de tiempo dependen del tamaño de la cubeta y electroporador utilizado). Añadir 1 ml de medio SOC y las células de transferencia a un tubo de 15 ml. Incubar durante 1 hora a 28-30° C, agitando a 100 rpm. Placa de 50 – 100 l de células en agar LB + antibiótico selectivo apropiado (depende del plásmido binario de la planta y la cepa de Agrobacterium utilizados en este protocolo de uso 50 mg / ml de kanamicina y 100 mg / ml de estreptomicina.). Las placas se incuban hasta 48 horas a 28-30 ° C. Repita el paso 2.5 para la selección de colonias y purificación de plásmidos. Repita el paso 3 para analizar el plásmido y para comprobar la integridad de la inserción y T-ADN antes de usar el constructo de floral-inmersión. Repita el paso 3.2, el uso de múltiples cebadores de PCR a través de toda la región de inserción y a través de las regiones de T-DNA y por secuenciación como en el paso 3.3. NOTA: En este protocolo 4 cebadores diferentes fueron diseñados a través del T-ADN y 10 iniciadores de todo el inserto. Una vez que se confirma la presencia del plásmido binario planta en la colonia Agrobacterium seleccionado, células de lugar in 50% de glicerol y se almacena a -80 ° C. Tienda colonias restantes de la placa a 4 ° C si se van a utilizar dentro de la semana 7. 6. Floral-inmersión NOTA: 2 días antes de Floral-inmersión: Crecer células de Agrobacterium a la fase estacionaria (OD 600 entre 0,5 a 1 es aceptable) en LB + antibióticos apropiados en medios líquidos. Nota: Estos son el mismo antibiótico como en el paso 5.6, basado en el vector binario de la planta y el tipo de cepa de Agrobacterium utilizada. Iniciar el cultivo con 1: 100 diluciones de un (5 ml) O cultivo saturado / N y crecer por 24 – 48 horas a 28-30 ° C con agitación a 150 rpm. La cultura debería haber llegado a la fase midlogarithmic y más probable será que se acerca o en fase estacionaria 1. DO de aproximadamente 0,8 (nuevo OD entre 0,5 a 1 son todas aceptables) 8. Recoger las células por centrifugación a 5000 xg a TA. Resuspender las células en medio de infiltración (5,0% de sacarosa + 0,05-0,003% Silwet L-77). Para la primera ronda de la inmersión, utilice 0,05% Silwet-77. Para la segunda y tercera rondas, reducir la concentración de 0,03% (detallado en Discusión). Continúe con el paso floral por inmersión. Coloque la planta en su lado y sumergir sólo las yemas visibles en el medio de infiltración durante 1-2 minutos. Deja la planta en su lado y cúbrala con papel de plástico para mantener la humedad alta en el domo (Figura 3). Al día siguiente, colocar la planta en una posición vertical y mantener normalmente. Cuando el brote se hace más grande (por lo general después de 10 – 14 días), repita los pasos 6.1 a 6.4. Reducir el tiempo de inmersión de 30 – 60 seg y Silwet-77 concentración de 0,003%. Mantener las plantas normalmente hasta que sus semillas son maduros y listos para ser recogido (Figura 4). 7. Selección de Tra Positivonsformants con PCR directa Sembrar las semillas T1 en suelo como en el paso 1.1. Alternativamente, hacer Murashige y Skoog medio de sal basal (medio MS) mediante la adición de 2,2 g de medio MS + 4 g de agar en 500 ml de agua. Autoclave y verter en pequeñas macetas. Mantener en el 4 ° C hasta su uso. Siembre la semilla que los coloca en el medio MS solidificado. Mantener bajo la luz del día largo (14 horas de luz y 10 horas de oscuridad). Las semillas germinan en unos 4-6 días (Figura 5). Utilice una semilla de cada flor como un punto de partida. Si no se obtiene transformante positivo, repita este paso escogiendo otra semilla de la flor. Nota: Pruebe diferentes semillas de las mismas flores, porque en algunos casos no se transformarán todas las semillas de una flor. Selección de semillas adicionales de las flores experimentales a veces es necesario. Compruebe en las plántulas con regularidad. En aproximadamente 10 – 14 días después de la germinación, cuando es verdaderodeja desarrollar, probar las plantas con PCR directa. Preparar el extracto de ADN hoja cortando 2 – 3 hojas (5-10 mg en peso) de cada plántula y colocarlos en un tubo de microcentrífuga. Añadir 180 l de NaOH 50 mM a cada tubo, y se incuba durante 10 min a 95 ° C. Neutralizar el extracto mediante la adición de 20 l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Utilice 1 l de extracto en la reacción de PCR directa, usando cebadores diseñados a través de la ADN-T o de la pieza de inserción (Figura 7), para seleccionar los transformantes positivos. En este protocolo, utilizar PCR directo con un mantenimiento inicial de 24 ° C, a continuación, 2 min a 98 ° C, seguido por 40 ciclos de (98 ° C durante 10 s, etapa de recocido durante 15 segundos, y una etapa de extensión a 68 ° C). Realizar una etapa de extensión final a 68 ° C durante 5 min seguido de una espera indefinida a 4 ° C. (Consulte la Tabla 1 para más detalles sobre imprimaciones, recocido temperaturas y tiempos de extensión de los ciclos). Identificar transformantes positivos y crecer hasta su vencimiento. Si las semillas se germinaron en medio MS, trasplante al suelo en una maceta más grande (Figura 5).