Floral-Dip Transformação de linho (<em> Linum usitatissimum</em>) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

1. cultivar as plantas 6 semanas antes da imersão, encher vasos de 5 polegadas com o solo e semear sementes de linho ¼ polegada de profundidade no solo (4 sementes por vaso). Certifique-se de firmar o solo sobre as sementes. Regue as plantas regularmente e mantê-los em tempo de verão (luz 14 horas e 10 horas escuro). Verifique plantas regularmente para inflorescências primárias (clusters de órgãos das flores). As plantas estão prontas para transformação, quando os botões são visíveis e têm apenas formada na inflorescência (Figura 1 e 2). Para ver os gomos, cortar as folhas em torno dele, se necessário. NOTA: Usando a melhor fase da flor é crítica e está detalhado na discussão. Use o principal ramo da planta para o tratamento experimental, uma vez que produz mais flores do que os ramos laterais. Use os ramos laterais ou como controles (não deve ser mergulhado) ou para outros tratamentos experimentais. Como alternativa, use os principais e secundários ramos damesma planta para o tratamento experimental e usar outra planta como um controle ou para outros tratamentos experimentais. Use etiquetas para marcar ramos individuais e flores individuais com a data e tipo de tratamento. 2. Clonagem e transformação em Escherichia coli (E. coli) Células Clonar o fragmento / gene de interesse no local de clonagem múltipla de um vector binário vegetal albergando o ADN-T. Realizar a clonagem em uma etapa ou duas etapas. Diretamente clonar pequenas inserções neste protocolo (~ 500 pb) no vetor binário planta. Neste protocolo, utilize o vetor binário planta (PRI909). Caso contrário, use quaisquer outros vetores binários de plantas em uma estratégia similar. Alternativamente, clonar grandes inserções (≥6.5 kb) em duas etapas: primeiro, utilizando um kit de clonagem comercial geral (não específico da instalação), então subclonar dentro do binário vector planta. Configurar uma reac PCRção para amplificar o gene de interesse. Desenhar os iniciadores com locais de restrição na extremidade 5 '(de acordo com o local de clonagem múltipla do vector binário vegetal em uso). Realizar um padrão de PCR utilizando ADN genómico de linho com as seguintes condições de ciclo: uma espera inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 94 ° C, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 2 min. Realizar uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. Os produtos de PCR separados de 1% de Tris / borato / EDTA (TBE) de gel de agarose, correr o gel a 100 V durante 1 h. Purificar os produtos a partir do gel e quantificar via Nanodrop. Configure a mistura de ligação para clonar o produto de PCR no vetor de clonagem comercial. Siga o protocolo do fabricante. Transformar a mistura de ligação em E. quimicamente competente células de E. coli como se segue. Adicione 2 mL da mistura de ligação em um frasco de chE. emically competente células de E. coli. Incubar em gelo durante 30 min. Choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C (tempo de choque de calor e a temperatura depende do tipo de células utilizado). Incubar em gelo e adicione 250 mL de caldo de super RT ideal com catabolite repressão (SOC) médio. Tapar o tubo e incubar num agitador orbital a 200 rpm a 37 ° C durante uma hora. Espalhe 10 – 50 ul de cada transformação sobre uma placa pré-aquecida LB (pré-aquecido a 37 ° C) + antibiótico selectivo apropriado (determinar o antibiótico selectivo de acordo com o tipo de vector de clonagem comercial utilizado). Incubar as placas a 37 ° CO / N. Escolha ~ 10 colônias para mini purificação prep plasmídeo, utilizando um kit comercial. Mini-prep de purificação de plasmídeo é geralmente realizada como se segue. NOTA: Os nomes de buffer são específicos para o kit comercial utilizado, mas as suas funções gerais são semelhantes. Inocular as colónias individuais em 2- 5 ml de meio LB contendo o antibiótico selectivo apropriado (determinado com base no tipo de vector utilizado comercial). Incubar durante cerca de 8 horas a 37 ° C com agitação vigorosa (~ 300 rpm). Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min. Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão a 250 ul. Misture e vortex para dispersar completamente o sedimento. Lise das células bacterianas através da adição de 250 ul de tampão de lise, misturar bem, invertendo os tubos 4 – 6 vezes. Neutraliza-se o lisado em tampão de neutralização e a inverter 4 – 6 vezes para misturar. Centrífuga por 10 min a ~ 17.900 xg em um microcentrifuge table-top. Transfira os sobrenadantes a partir do passo anterior a uma coluna de centrifugação. Centrifugar novamente a ~ 17.900 xg por 30 – 60 seg. Lava-se a coluna de centrifugação por adição de tampão de lavagem de 0,75 ml e centrifugar por 30 – 60 seg. Descartar o fluxo de passagem. Centrífuga para um adicional de 1 min a remove tampão de lavagem residual. Coloque a coluna de rotação em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo. Para eluir o ADN, adicionar 50 ul de água para o centro de cada coluna. Deixe descansar por 1 min, e centrifugar por 1 min. 3. Analisar o Purificada plasmídeos para a presença de Insert Restrição Digest: Defina-se uma digestão de restrição para determinar a presença da inserção por digestão do plasmídeo com as enzimas de restrição utilizados para clonar o inserto. Uma restrição típico digestão dupla reacção da seguinte forma: 1 ug de plasmídeo purificado, 1 ul de cada uma das enzimas de restrição, 2 ul de 10x tampão de digestão de restrição + 2 ul de BSA (se aplicável), X ul de água (para um total de 20 ul) Misturar suavemente e incuba-se à temperatura recomendada (varia de uma enzima para o outro). Analisar a digestão de restrição de reacção em 1% de gel de agarose TBE, executar a 100 V durante 1 h e procurar o abandono de tamanho apropriado. A análise de PCR: Defina-se uma PCR com o plasmídeo purificado, utilizando iniciadores da região vector comercial para amplificar interior da inserção ou junção entre o vector e da inserção. Primers comuns são M13 frente e verso, e primers T3 / T7. Neste protocolo, utilizar as seguintes condições de ciclos de PCR: uma espera inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 94 ° C, seguido de 18 ciclos a 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 2 min. Realizar uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. Produtos de Carga de PCR em um 1% TBE em gel de agarose e correr para 100-120 V durante 1 hora. Sequencing: Enviar o plasmídeo purificado para um serviço de sequenciação comercial para analisar e confirmar a presença do inserto. Uma vez que a construção correcta é obtida, utilizá-lo para a segunda etapa de clonagem (na planta vector binário). NOTA: As etapas 2,3-3,3pode ser eliminado se a conclusão da clonagem em uma etapa. 4. Clonagem no Binary Vector Vegetal (PRI909) e E. coli Transformation Defina-se uma digestão dupla reacções de restrição para linearizar o vector binário vegetal e isolar o inserto clonado anteriormente usando os mesmos locais de enzimas de restrição que foram adicionados aos iniciadores (passo 2.2). Analisar as digestões de restrição usando electroforese em gel, executar a 100 V durante 1 – 2 h. Cortar a inserção e o vector binário vegetal linearizado a partir do gel. Use um kit comercial para purificar os produtos em gel. Consulte o manual do fabricante. Configurar uma reacção de ligação para ligar a inserção no vetor binário planta. O inserto para vector proporção depende do tamanho do inserto e o vector binário vegetal. Neste protocolo a inserção LIS1 foi de 6,5 kb e a planta vetor binário foi de 9 kb. Portanto, utilizar uma mistura 1: 2 de inserção relação vector. <li> Repita os passos de 2,4-3 para a transformação de bactérias, purificação de plasmídeo e análise. Uma vez que a construção correcta (insert + planta vetor binário) é obtido, prossiga para a eletroporação na etapa 5. 5. A electroporação para Agrobacterium tumefaciens células eletro-competentes Descongelar um frasco de Agrobacterium tumefaciens células eletricamente competentes no gelo. Adicionar 1 ng de ADN do vector plasmídico binário de 20 ul de células competentes, em gelo, e misturar suavemente. Refrigere a eletroporação tina 0,1 centímetros no gelo. Transferir a mistura de célula / DNA competente às cuvetes de electroporação, e toque para recolher a mistura na parte inferior. Coloque a cuvete na máquina electroporador e pulso (condições de tensão e de tempo depende do tamanho de cuvete e o electroporador utilizado). Adicionar 1 ml de meio SOC e as células de transferência para um tubo de 15 ml. Incubar durante 1 hora a 28-30° C, agitação a 100 rpm. Placa 50 – 100 ul de células em agar LB + antibiótico selectivo apropriado (dependem do plasmídeo binário planta e a estirpe de Agrobacterium utilizada Neste protocolo de utilização de 50 ug / ml de canamicina e 100 ug / ml de estreptomicina.). Incubar as placas até 48 horas a 28 – 30 ° C. Repita o passo 2.5 para seleção colônia e purificação plasmídeo. Repetir o passo 3 para analisar o plasmídeo e para verificar a integridade da inserção do T-DNA e antes utilizando a construção para floral-imersão. Repita o passo 3.2, utilizando vários iniciadores de PCR em toda a região de inserção inteiro e em todas as regiões de T-DNA e por seqüenciamento como no passo 3.3. NOTA: Neste protocolo de 4 diferentes iniciadores foram desenhados através do T-DNA e 10 iniciadores em todo o inserto. Uma vez que a presença da planta plasmídeo binário na colônia Agrobacterium selecionado for confirmada, células lugar que eun 50% de glicerol e armazenar a -80 ° C. Loja restantes colónias na placa a 4 ° C, se eles são para ser usado dentro de uma semana 7. 6. Floral-dipping NOTA: 2 dias antes do floral-dipping: Cultivar células de Agrobacterium para a fase estacionária (OD 600 entre 0,5-1 é aceitável) em LB + antibióticos adequados no meio líquido. NOTA: Estes são os mesmos antibióticos como na etapa 5.6, com base no vector binário vegetal e o tipo de estirpe de Agrobacterium utilizada. Iniciar a cultura com 1: 100 de um diluições saturado (5 ml) O / N e a cultura crescer durante 24-48 horas a 28-30 ° C, agitando a 150 rpm. A cultura deve ter alcançado a fase midlogarithmic e mais provável será que se aproxima ou na fase estacionária 1. OD de aproximadamente 0,8 (novamente OD entre 0,5 a 1 são aceitáveis) 8. Recolher as células por centrifugação a 5.000 xg à temperatura ambiente. Ressuspender as células em meio de infiltração (5,0% de sacarose + 0,05-0,003% de Silwet L-77). Para a primeira rodada do descenso, use 0,05% Silwet-77. Para a segunda e terceira rondas, para reduzir a concentração de 0,03% (em Discussão detalhada). Prossiga com o passo floral-dip. Coloque a planta em seu lado e mergulhar apenas os botões visíveis no meio de infiltração para 1-2 min. Deixe a planta do seu lado e cubra-a com filme plástico para manter a umidade alta na cúpula (Figura 3). No dia seguinte, colocar a planta em posição vertical e manter normalmente. Quando o broto cresce maior (geralmente depois de cerca de 10-14 dias), repita os passos de 6,1-6,4. Reduzir o tempo de imersão de 30-60 seg e Silwet-77 concentração de 0,003%. Manter as plantas normalmente até que suas sementes são maduros e prontos para serem recolhidos (Figura 4). 7. Seleção de Tra Positivensformants com PCR direto Semear as sementes T1 no solo como no passo 1.1. Como alternativa, fazer Murashige e Skoog sal basal (meio MS), adicionando 2,2 g de MS médio + 4 g de ágar-ágar em 500 ml de água. Autoclave e despeje em pequenos vasos de plantas. Mantenha a 4 ° C até ser utilizado. Semear a semente, colocando-os no meio MS solidificado. Manter sob longo luz do dia (14 horas de luz e 10 horas de escuro). As sementes germinaram em cerca de 4-6 dias (Figura 5). Use uma semente de cada flor como um ponto de partida. Se não transformante positivo é obtido, repita este passo, escolhendo outra semente da flor. Nota: Teste diferentes sementes das mesmas flores, porque em alguns casos nem todas as sementes de uma flor será transformado. A seleção de sementes adicionais de flores experimentais às vezes é necessário. Confira nas plântulas regularmente. Em cerca de 10 – 14 dias após a germinação, quando verdadeirodeixa desenvolver, testar as plantas com PCR direto. Prepare o extrato de folha de DNA por corte 2-3 folhas (5-10 mg de peso) de cada muda e colocá-los em um tubo de microcentrífuga. Adicionar 180 ul de NaOH 50 mM a cada tubo, e incubar durante 10 min a 95 ° C. Neutraliza-se o extracto por adição de 20 ul de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0). Use 1 ul do extracto na reacção directa de PCR, utilizando primers desenhados em todo o T-DNA ou a insero (Figura 7), para seleccionar transformantes positivos. Neste protocolo, utilizar PCR directo, com uma fixação inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 98 ° C, seguido de 40 ciclos de (98 ° C durante 10 segundos, o passo de recozimento durante 15 segundos, e um passo de extensão a 68 ° C). Execução de uma etapa de extensão final a 68 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. (Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre primers, temperaturas de recozimento e tempos de extensão para os ciclos). Identificar transformantes positivos e cultivá-las até o vencimento. Se as sementes foram germinadas em meio MS, transplante para o solo em um vaso maior (Figura 5).