아마의 꽃 - 딥 변환 (<em> LINUM usitatissimum</em>) 높은 변환 속도와 형질 전환 자손을 생성합니다
Summary
여기, 우리는 꽃 딥 통해 아그로 박테 리움을 매개 성 식물 형질 전환을 사용하여 아마 변환하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 수행 간단하고 저렴하면서도 아마 변환에 대한 현재 가능한 방법보다 더 높은 변환 속도를 산출한다.
Abstract
플로랄 딥 아그로 박테 리움 – 매개를 통해 식물 형질 전환 식물의 분야에서 널리 사용되는 기술이며, 많은 식물 종에 대한 성공적인 것으로보고되었다. 그러나, 꽃 딥에 의해 아마 (LINUM의 usitatissimum) 변환은보고되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목표는 아그로 박테 리움을 확립하고 플로랄 딥 방법은 형질 아마를 생성하는데 사용될 수있다. 우리는이 기술이, 간단 저렴하고 효율적이고, 더 중요한 것은, 아마 변환 가능한 현재의 방법보다 더 높은 변환 속도를 보여 준다.
2 분 – 요약하면, 아마씨 화서는 1 이진 벡터 플라스미드 (T-DNA 단편 플러스 LINUM 삽입 서열 LIS-1)을 운반하는 아그로 박테 리움 용액에 침지 하였다. 식물은 24 시간 동안 옆으로 젖혀졌다. 이어서, 식물은 다음 처리 될 때까지 정상 성장 조건하에 유지 하였다. 사전 처리디핑 (14) 사이에 일 간격 – 약 10으로 3 회, – 침지 S 2를 반복 하였다. T1 씨앗 수집 및 토양에 발아했다. 약 2 주 후, 처리 자손이 직접 PCR에 의해 시험 하였다; 2-3 잎 식물 플러스 적절한 T-DNA 프라이머 당 하였다. 긍정적 인 형질 전환을 선택하고 만기로 성장했다. 긍정적 인 형질 전환되는 처리 식물 씨앗의 60 % – 변환 속도는 50, 예기치 않게 높았다. 이 애기 장대와 꽃 – 딥 변환을 사용하여 다른 식물 종에 대해보고 된 것보다 더 높은 변환 속도이다. 이 변환을위한 다른 방법을 이용하여 형질 전환 아마, 또한 지금까지보고 된 가장 높은 것이다.
Introduction
아마 (LINUM의 usitatissimum)는 자사의 섬유 및 오일 널리 재배 중요한 작물이다. 아마 게놈의 변환은 상처, 아그로 박테 리움 감염 및 조직 문화에서의 공동 재배, 재생 다음과 유전자 입자 또는 초음파 초음파를 적용하는 등의 방법으로 가능하다. 그러나, 이들 기술은 많은 돌연변이 사건 성향 및 트랜스 제닉 라인을 얻기 위해 장시간을 포함하여 많은 단점을 가지고있다. 이러한 방법 중 일부는 비용이 낮은 복구 모종의 결과로, 악기의 유능하고 효율적인 조작을 필요로 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은, 이들 기술은 종종 저 변태 속도 2,6 초래한다.
플로랄 딥 아그로 박테 리움 – 매개를 통해 식물 형질 전환은 형질 전환 식물체를 생성하는 간단하고 효과적인 방법이다. 그것은 일상적 성공적으로 애기 장대 thalian으로 많은 식물 종에 사용 된1,4, 개자리 속에서 truncatula (11), 토마토 (12), 밀 (13) 옥수수 (10). 그러나, 이로 인해 아마 의해 생성 꽃의 낮은 번호 등의 여러 가지 요인에 아마 변환을위한 실용적인 기술로서 간주되지 않은 각 꽃, 큰 종자 크기, 후막로부터 얻은 종자 제한된 수 또한, 유전 적 변형 과정에 문제가 될 수있다. 자손을 미 변태 어느 발아 또는 발아하지만 표백제 없지만 또한, 플로랄 딥 방법의 선택 부분은, 발아 및 녹색 유지하는 능력에 기초하여 구별 형질 전환 된 자손과 항생제를 함유 식물 매체에 형질 전환 종자 발아 필요 밖으로 신속하고 죽는다. 현재의 문헌에서, 야생형 아마 기반 위양성 결과를 생성하고, T1의 자손의 선택을, 항생제 선택 고농도 벗어날 경향이 주목 받고항생제 내성에 6,14 더 어렵다. 항생제의 고농도 선발 배지에 첨가 될 때 또한, 관찰 된 변형의 속도는 급격히 떨어 구.
이 프로토콜에서는 게놈 3,5-을 변경함으로써 환경 스트레스에 반응하는 것으로 나타났다 섬유 아마, 스토 몬트의 촉 (응답 및 플라스틱)의 라인을 변형하는 아그로 박테 리움과 플로랄 딥 방법을 사용 하였다. 항생제 이스케이프 문제를 극복하기 위해, 우리는 식물 미디어에 항생제를 첨가하여 선택하는 대신에, T1 잎에서 DNA의 직접 PCR 시험을 위해 선택했다. 우리는 처리시 특정 꽃을 추적 아마씨 단순한 해부학 이용했다. 이 추적 시스템은 항생제를 추가하지 않고 토양에 대한 특정 꽃과 발아 종자의 선택을 허용했다. 포지티브 형질 전환 DNA는 단순히 신속하고 효율적인 방법을 사용하여 O 잎에서 얻어진 시험함으로써 확인되었다F 직접 PCR. 우리의 결과는 꽃 딥 방법은 아마이 줄을 매우 잘 작동하고 놀라 울 정도로 매우 높은 변환 속도 결과 입증 – 이전 것으로보고 된 애기 장대, 관찰보다 높은 (50 ~ 60 %) 0.1-1 % 1, 그리고 다른 식물 종 (10, 12)보다도 더 높은. 우리는 또한 아마씨 (오일 아마)의 또 다른 다양한 베순 테스트 (안정적이고 무응답), 우리의 예비 데이터가 꽃 딥도 아마이 다양한 작동을 나타냅니다.
이 프로토콜의 목적은 아그로 플로랄 딥이 트랜스 제닉 아마를 생성하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 우리는이 기술이 간단하고 저렴하고, 아마 변환의 다른 방법보다 빠르다 것을 보여준다. 더 중요한 것은 아마 2,6 변형의 다른 방법보다 훨씬 높은 레이트 변환을 초래한다. 많은 가지와 꽃이 애기 장대의 해부학, 엄마KES는 어려운 감소와 같은 공장에 꽃을 비침 구분하기 위해. 따라서, 많은 수의 씨는 당 약 20,000 식물 씨앗, 양성 형질 전환 체를 식별하는 8 스크리닝 될 필요가있다. 아마, 다른 한편으로는, 그것이 가능 개별 꽃을 추적하고 처리를 스크리닝하는 동안 특정 종자를 선택하게 식물 당 약 100 개의 종자를 생산 적은 브랜치 (하나의 메인 분기 및 몇 곁가지) 적은 꽃을 갖는다.
우리는 꽃 딥은 아마의 모든 관련 종, 약 200 종의 속을 변환 할 수있는 적용 방법이라고 제안한다. 이 메소드는 아마 변환의 다른 방법보다 훨씬 높은 변형 속도를 제공한다. 우리는 또한 T1 잎 DNA의 직접 PCR 검사는 종종 많은 오탐 (false positive)을 생산하고 항생제 내성 탈출의 문제를 극복 할 수있는 효율적인 방법이라고 제안한다. 직접 PCR 검사는 다른 종의 식물에 적용 할 수 있고, t를 한정되지아마 오. 이 프로토콜에서 사용되는 간단한 시드 추적 기술은 아마 비슷한 해부학 분파 모든 다른 식물 종에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 아마 (LINUM의 usitatissimum)와 같은 일부 식물 종에서, 성공적인 식물 형질 전환은 제한되고있다. 이전의 변환은 아마 부상과 공동 배양, 유전자 총 입자를 적용하거나 재생이어서 초음파 초음파를 이용하여 아그로 박테 리움 감염을 요구하고있다; 긴 경향이 둘 다 과정은 많은 돌연변이 이벤트 수반된다. 또한, 이들 기술의 선택 프로세스 카나마이신과 같은 항생제 선별 마커의 사용을 요구한다. 그러나, 아마 항생제 6,9,14의 높은 농도를 탈출하는 경향이 선택이 방법은 많은 잘못된 반응을 생산 문헌에서 언급되고있다. 아마 변환 이전의 기술의 다른 단점은 낮은 변형 속도 2,6이었다.
여기에 설명 된 프로토콜에서 꽃-찍기를 통해 아그로 박테 리움 – 매개 식물 형질 전환이 나타났다(50-60%) 아마에 대한 높은 변환 속도가 발생할 수 있습니다. 형질 전환 주 및 측면 지점에서 담근 수집 꽃에서 얻어졌다. 긍정적 인 형질 전환 체의 선택은 단순히 의해 통과 항생제 선택의 사용을 토양에 T1 식물 성장하고 발아 직후 잎을 선별에 의해 수행되었다, 단계 이전에 다른 종의 식물 꽃 딥의 표준으로 사용. 나뭇잎의 직접 PCR 시험을 수행하고, 해당 T-DNA 프라이머를 사용하여, 양성 형질 빠르게 선택할 수있다. 이 기술은이 방법 1,10,12를 사용하여 이전에 애기 장대와 다른 식물 종에 대해보고 된 것보다 훨씬 더 높은 변환 속도에, 간단한 저렴하고 편리하게 수행 할 수, 아직 결과. 또한 아마보고 된 가장 높은 변환 속도이다.
그러나, 가장 꽃 스테이지의 선택과 최고의 계면 활성제의 농도를 포함하는 절차에 중요한 단계가되도록 존재아그로 박테 리움은 꽃의 장기를 죽이지 않고 식물 세포에 침투 할 수 있습니다. 초기 새싹 스테이지 0.05 % 이하의 높은 웨트-77 농도 (도 2A)를 사용하는 경우, 개발이나 꽃 씨앗을 설정하지 않을 것이다. 변환 일 수도 있지만 늦은 봉오리 단계는, (도 2C)를 사용하는 경우 훨씬 더 낮은 비율로 발생한다. 유사한 결과가 애기 플로랄 딥 변환 1,4 얻었다. 이 프로토콜의 경우, 모든 꽃 단계는 초 침지에이어서 다른 웨트-77 농도로 시험하고, 최선 단은 제 찍기 위해 0.05 %의 웨트 – (77)와 중간 봉오리 단계 (도 2C)로 측정되었다 0.03 %의 약간 감소 웨트-77 농도 늦은 봉오리 단계 (도 2C). 변환은 또한 다음에, 0.003 %의 낮은 웨트-77 농도의 초기 봉오리 단계 (도 2A)를 사용하여 잘 작동0.05 %의 높은 웨트-77 농도의 중간 새싹 단계 (그림 2B)와 두 번째 찍기.
이 프로토콜에서, 몇몇 다른 파라미터 변환 속도를 최적화하기 위해 시도하지만, 최종 결과에 아무런 효과가없는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면 식물이 자신의 옆에 누워 한 날부터 이틀 플라스틱으로 덮여 있음을 침지 후 시간을 연장 포함; 아그로 배양 중 하나 이상을 사용하여 OD 대신 0.5-1; 15 분 대신 1 – – 2 분 5 침지 시간을 증가시킬 수있다. 다시 우리는 이러한 전략을 사용하여 변환 속도에 영향을 발견하지 않았습니다. 가장 효과적인 인자 그러나, 정확한 꽃 단계에서 건강한 식물을 사용하고 최상의 웨트-77의 농도를 사용하는 것으로 밝혀졌다. 우리는 두 찍기 간격, 한 시간 침지도 작동하더라도, 어떻게 든 더 이상 시간을 작동하는 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 대한 수정은 reducin에 의해 달성 될 수있다g 번째 또는 세 번째 디핑 같이 작은 0.003 %까지 웨트-77 농도. 웨트-77 독성이기 때문에, 꽃에 너무 높은 농도 결과 시드의 수율로 수득 저조한 현상. 식물 건강 찾고되지 않고 싹이 잘 개발되어 있지 않은 경우 두 번째 또는 세 번째 이벤트를 제거하여 침지 주파수는 1로 삭감 할 수있다.
이 기술의 주요 제한은 아마, 꽃에서 얻어지는 각 씨의 제한된 수 및 아마의 긴 수명에 의해 생성 꽃의 수가 적은 것이다. T1 세대에 도착 십주 후 찍기 – 첫번째 찍기 위해 준비 차 새싹과 추가 8을 가지고 종자 파종에서 팔주 – 그것은 6 걸립니다. 총 5의 범위 – 6 개월 T1 세대를 얻을 필요가있다. 다른 종의 식물과는 달리 어떤 꽃 언제든지 올해의 올해 특정 시간에 일부 아마 품종 꽃보다. 이 기술에 대한 그래서 사려 깊은 계획이 중요합니다.
<p cl요약 엉덩이 = "jove_content">는 두 개의 서로 다른 아마 품종 꽃 딥 우리의 결과 : 섬유 아마는 스토 몬트 러스 (응답 및 플라스틱), 및 오일 아마는 (안정적이고 무응답) 베순, 즉 아그로 박테 리움을 보여 – 플로랄 딥 통해 매개 된 식물 형질 전환은 아마 변환을위한 적용하고 효율적인 방법이며 아마 변환에 대한 이전에 사용 된 기법을 대체하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜의 꽃 딥 방법의 수정은 다른 식물 종에 사용하기 위해 적용하고 아마로 제한되지 않습니다.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Ogelbay fund.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| greenhouse with appropriate light setting | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electropheresis equipment | |||
| digital imaging setup | |||
| Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
| GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
| Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
| Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
| TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
| sucrose | fischer scientific | ||
| electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
| Shaker | |||
| spinner | |||
| platic wrap and aluminum foil wrap | |||
| speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
| QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
| SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
| SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
| T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
| Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
| Agar | fisher scintific | A360-500 |
References
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
- Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
- Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
- Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2 (16), (2006).
- Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
- Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
- Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).
- Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).
- Yasmeen, A., et al. In Planta transformation of tomato. Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).
- Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
- Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).
