Trasformazione Floral-Dip di lino (<em> Linum usitatissimum</em>) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

1. Crescere Piante 6 settimane prima immersione, riempimento 5 pentole pollici con terreno e seminare semi di lino ¼ pollice profondo nel terreno (4 semi per piatto). Assicurati di rassodare il terreno sopra i semi. Innaffiare le piante regolarmente e mantenere in lungo luce diurna (luce 14 ore e 10 ore scuro). Controllare le piante regolarmente infiorescenze primari (cluster di organi fiori "). Le piante sono pronte per la trasformazione quando le gemme sono visibili e hanno appena formata nella infiorescenza (figura 1 e 2). Per vedere i germogli, tagliare le foglie intorno ad esso, se necessario. NOTA: Usando il miglior palcoscenico fiore è critica ed è dettagliato nella discussione. Utilizzare il ramo principale dell'impianto per il trattamento sperimentale in quanto produce più fiori che i rami laterali. Utilizzare i rami laterali sia come controlli (non essere immersi) o per altri trattamenti sperimentali. In alternativa, utilizzare i principali e laterali ramistesso impianto per il trattamento sperimentale e utilizzare un'altra pianta come controllo o per altri trattamenti sperimentali. Utilizzare le etichette per contrassegnare i singoli rami e fiori singoli con la data e il tipo di trattamento. 2. Clonazione e trasformazione per Escherichia coli (E. coli) Cells Clone il frammento / gene di interesse nel sito di clonaggio multiplo di una pianta vettore binario ospitare il T-DNA. Eseguire la clonazione in un passo o due gradini. Direttamente clonare piccoli inserti in questo protocollo (~ 500 bp) nell'impianto binario vettoriale. In questo protocollo, utilizzare lo stabilimento vettore binario (PRI909). In caso contrario, utilizzare altri vettori binari di piante in una strategia simile. In alternativa, clonare inserti di grandi dimensioni (≥6.5 kb) in due fasi: la prima con un kit generale clonazione commerciale (non piantare specifico), poi sottoclone nella pianta vettore binario. Impostare una reazione PCRzione per amplificare il gene di interesse. Progettare i primer con siti di restrizione alla fine del 5 '(secondo il sito di clonazione multiplo pianta del vettore binario in uso). Eseguire PCR standard utilizzando DNA genomico di lino con le seguenti condizioni di ciclo: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec, e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. I prodotti di PCR separate sul 1% Tris / borato / EDTA (TBE) gel, corrono il gel a 100 V per 1 ora. Purificare i prodotti dal gel e quantificare via Nanodrop. Impostare il mix legatura per clonare il prodotto di PCR nel vettore di clonaggio commerciale. Seguire il protocollo del produttore. Trasforma il mix legatura in chimicamente competente E. coli come segue. Aggiungere 2 ml di mix legatura in un flaconcino di chemically competente E. coli. Incubare in ghiaccio per 30 min. Heat Shock le cellule per 30 sec a 42 ° C (Heat tempo shock e temperatura dipende dal tipo di cellule utilizzate). Incubare in ghiaccio e aggiungere 250 ml di brodo RT eccellente ottimale con repressione da cataboliti (SOC) di media. Chiudere la provetta e incubare in un agitatore orbitale a 200 rpm a 37 ° C per un ora. Distribuire 10 – 50 microlitri da ogni trasformazione su una piastra preriscaldata LB (preriscaldata a 37 ° C) + antibiotico appropriato selettiva (determinare l'antibiotico selettivo in base al tipo di clonazione commerciale vettore utilizzato). Incubare le piastre a 37 ° CO / N. Scegli ~ 10 colonie per mini depurazione preparazione plasmide, utilizzando un kit commerciale. Mini purificazione preparazione plasmide viene generalmente eseguita come segue. NOTA: i nomi di buffer sono specifici per il kit commerciale utilizzato, ma le loro funzioni generali sono simili. Inoculare le singole colonie in 2- 5 ml terreno LB contenente l'antibiotico selettiva appropriata (determinato in base al tipo di vettore commerciale utilizzato). Incubare per circa 8 ore a 37 ° C con scuotimento vigoroso (~ 300 rpm). Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min. Risospendere il pellet nel tampone di risospensione 250 microlitri. Mescolare e vortex per disperdere completamente il pellet. Lyse le cellule batteriche aggiungendo 250 ml di tampone di lisi, mescolare accuratamente invertendo i tubi 4 – 6 volte. Neutralizzare il lisato nel buffer neutralizzazione e invertire 4 – 6 volte per mescolare. Centrifugare per 10 minuti a ~ 17.900 xg in una microcentrifuga tavolo. Trasferire il surnatante dal passaggio precedente per una colonna di spin. Centrifugare nuovamente ~ 17.900 xg per 30 – 60 a sec. Lavare la colonna di spin aggiungendo 0,75 ml tampone di lavaggio e centrifuga per 30-60 sec. Gettare il flow-through. Centrifuga per un ulteriore 1 min Remove tampone di lavaggio residuo. Porre la colonna di spin in un ambiente pulito 1,5 ml provetta. Per eluire DNA, aggiungere acqua 50 microlitri al centro di ogni colonna. Lasciate riposare per 1 minuto, e centrifugare per 1 min. 3. Analizzare il purificato Plasmidi per la presenza di Insert Limitazione Digest: Impostare una restrizione digest per determinare la presenza dell'inserto per digestione del plasmide con gli enzimi di restrizione usati per clonare l'inserto. Un tipico doppio restrizione digerire reazione come segue: 1 mg di plasmide purificato, 1 ml di ogni enzimi di restrizione, 2 ml 10x restrizione digerire tampone + 2 pl BSA (se applicabile), X ml di acqua (per un totale di 20 microlitri) Miscelare delicatamente e incubare a temperatura consigliata (varia da un enzima all'altro). Analizzare la restrizione digerire reazione 1% TBE gel, correre a 100 V per 1 ora e cercare drop-out di dimensioni adeguate. Analisi PCR: Impostare una PCR con il plasmide purificato, utilizzando primer dalla regione vector commerciale per amplificare all'interno dell'inserto o la giunzione tra il vettore e l'inserto. Primer comuni sono M13 avanti e indietro e primer T3 / T7. In questo protocollo, utilizzare le seguenti condizioni di ciclo di PCR: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 18 cicli a 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. Prodotti Load PCR su un TBE gel 1% e correre per 100 – 120 V per 1 ora. Sequencing: Invia il plasmide purificato in un impianto commerciale sequenziamento per analizzare e confermare la presenza dell'inserto. Una volta ottenuto il costrutto corretta, utilizzare per la seconda fase di clonazione (nella pianta vettore binario). NOTA: i passaggi 2,3-3,3può essere eliminato se la clonazione è completata in un solo passo. 4. Clonazione nell'impianto Binary Vector (PRI909) e E. coli Transformation Impostare una doppia restrizione digerire reazioni linearizzare la pianta vettore binario e isolare l'inserto precedentemente clonato utilizzando gli stessi siti di restrizione enzimi che sono stati aggiunti i primer (punto 2.2). Analizzare i digest restrizione con elettroforesi su gel, correre a 100 V per 1 – 2 ore. Tagliare l'inserto e la pianta linearizzato vettore binario dal gel. Utilizzare un kit commerciale per purificare i prodotti in gel. Consultare il manuale del costruttore. Impostare una reazione legatura per legare l'inserto nella pianta vettore binario. L'inserto rapporto vettore dipende dalla dimensione dell'inserto e la pianta vettore binario. In questo protocollo l'inserto LIS1 era 6,5 ​​kb e la pianta vettore binario è stato di 9 kb. Quindi, utilizzare un 1: 2 inserto rapporto vettoriale. <li> Ripetere i passaggi 2,4-3 per la trasformazione batterica, la purificazione plasmide e analisi. Una volta ottenuto il costrutto corretta (insert + pianta vettore binario), procedere al elettroporazione al punto 5. 5. elettroporazione in Agrobacterium tumefaciens Cells elettricamente competenti Scongelare una fiala di Agrobacterium tumefaciens cellule elettricamente competenti sul ghiaccio. Aggiungere 1 ng di binario DNA vettore plasmidico a 20 ml di cellule competenti, sul ghiaccio, e mescolare delicatamente. Raffreddare un 0,1 centimetri cuvetta elettroporazione sul ghiaccio. Trasferire la miscela cellule / DNA competente per le cuvette di elettroporazione, e toccare per raccogliere la miscela a fondo. Inserire la cuvetta nella macchina elettroporatore e impulsi (condizioni di tensione e di tempo dipendono dalle dimensioni della cuvetta e elettroporatore utilizzato). Aggiungere 1 ml di media SOC e cellule di trasferimento in una provetta da 15 ml. Incubare per 1 ora a 28 – 30° C, agitando a 100 rpm. Tavola 50 – 100 microlitri di cellule su agar LB + antibiotico appropriato selettiva (dipende dalla pianta plasmide binario e il ceppo di Agrobacterium utilizzata In questo uso protocollo 50 ug / ml di kanamicina e 100 mg / ml di streptomicina.). Incubare le piastre fino a 48 ore a 28 – 30 ° C. Ripetere il punto 2.5 per la selezione delle colonie e purificazione plasmide. Ripetere passaggio 3 per analizzare il plasmide e per verificare l'integrità dell'inserto e T-DNA prima di utilizzare il costrutto floreale-dipping. Ripetere il passaggio 3.2, l'utilizzo di più primer PCR in tutta la regione inserita e in tutte le regioni T-DNA e sequenziamento come al punto 3.3. NOTA: In questo protocollo 4 primer diversi sono stati progettati in tutto il T-DNA e 10 primer attraverso l'inserto. Una volta che la presenza della pianta plasmide binario nella colonia Agrobacterium selezionata viene confermata, luogo celle in 50% glicerolo e conservare a -80 ° C. Conservare rimanendo colonie sulla piastra a 4 ° C se devono essere utilizzati entro una settimana 7. 6. Floral-immersione NOTA: 2 giorni prima Floreale-immersione: Crescere cellule tumefaciens alla fase stazionaria (OD 600 tra 0,5-1 è accettabile) in LB + antibiotici appropriati in mezzi liquidi. NOTA: Questi sono gli stessi antibiotici come al punto 5.6, in base vegetale vettore binario e il tipo di ceppo Agrobacterium utilizzato. Avviare la coltura di 1: 100 di diluizioni saturo (5 ml) O / N cultura e crescere per 24 – 48 ore a 28-30 ° C agitando a 150 rpm. La cultura dovrebbe aver raggiunto la fase midlogarithmic e più probabile sarà avvicinamento o in fase stazionaria 1. OD di circa 0,8 (OD nuovamente tra 0,5 e 1 è tutto accettabile) 8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 5.000 xg a RT. Risospendere le cellule in terreno infiltrazione (5,0% di saccarosio + ,05-0,003% Silwet L-77). Per il primo turno di immersione, utilizzare 0,05% Silwet-77. Per il secondo e terzo ciclo, ridurre la concentrazione di 0,03% (descritto Discussione). Procedere con il passo floreale-dip. Posare la pianta su un fianco e immergere solo i germogli visibili nel mezzo di infiltrazione per 1-2 min. Lasciare la pianta su un lato e coprire con pellicola trasparente per mantenere alta umidità nella cupola (Figura 3). Il giorno successivo, posizionare l'impianto in posizione verticale e mantenere normalmente. Quando la gemma cresce più grande (di solito dopo circa 10 – 14 giorni), ripetere i passaggi 6,1-6,4. Ridurre il tempo di immersione per 30-60 sec e Silwet-77 concentrazione 0,003%. Mantenere le piante normalmente fino loro semi sono maturi e pronti per essere raccolti (figura 4). 7. La selezione di Tra Positivensformants con PCR diretta Seminare i semi T1 sul suolo come al punto 1.1. In alternativa, fare Murashige e Skoog sale basale (MS media) con l'aggiunta di 2,2 g di MS media + 4 g di agar-agar in 500 ml di acqua. Autoclave e versare in piccoli vasi per piante. Conservare nel 4 ° C fino all'uso. Seminare il seme mettendoli sul supporto MS solidificato. Tenere sotto lunga diurna (luce 14 ore e 10 ore di buio). I semi germinano in circa 4-6 giorni (Figura 5). Utilizzare un seme di ogni fiore come un punto di partenza. Se si ottiene alcun trasformante positivo, ripetere questo passaggio con la scelta di un altro seme dal fiore. NOTA: test semi diversi dagli stessi fiori, perché in alcuni casi non tutti i semi da un fiore saranno trasformati. Selezione di semi supplementari da fiori sperimentali volte è necessario. Controllare sulle piantine regolarmente. In circa 10 – 14 giorni dopo la germinazione, quando la veralascia sviluppare, testare le piante con PCR diretta. Preparare l'estratto di foglie di DNA tagliando 2 – 3 foglie (5-10 mg in peso) da ciascuna piantina e metterli in una provetta. Aggiungere 180 ml di NaOH 50 mm per ogni tubo, e incubare per 10 minuti a 95 ° C. Neutralizzare l'estratto aggiungendo 20 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Usare 1 ml di estratto nella reazione diretta PCR, utilizzando primer disegnati tutti i T-DNA o l'inserto (Figura 7), per selezionare trasformanti positivi. In questo protocollo, utilizzare PCR diretta con una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 min a 98 ° C, seguiti da 40 cicli di (98 ° C per 10 sec, fase di ricottura per 15 secondi, ed una fase di allungamento a 68 ° C). Eseguire una fase di estensione finale a 68 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. (Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli su primer, temperature di ricottura e tempi di estensione per i cicli). Identificare trasformanti positivi e farle crescere alla maturità. Se i semi sono stati germinati in mezzo MS, trapianto suolo in un vaso più grande (Figura 5).