Floral-Dip Transformation von Flachs (<em> Linum usitatissimum</em>), Um Transgene Progenies mit hoher Umwandlungsrate generieren

1. Wachsende die Pflanzen 6 Wochen vor dem Eintauchen, füllen 5-Zoll-Töpfe mit Erde und säen Leinsamen ¼ Zoll tief in den Boden (4 Samen pro Topf). Achten Sie darauf, den Boden in den Samen festigen. Wasser die Pflanzen regelmäßig und halten sie in langen Tageslicht (14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit). Überprüfen Pflanzen regelmäßig auf primäre Blütenstände (Cluster von Organen Blumen '). Die Pflanzen sind bereit für die Transformation, wenn die Knospen sichtbar und haben gerade in der Blütenstand (Abbildung 1 und 2) gebildet. Um die Knospen zu sehen, schneiden Sie die Blätter um ihn gegebenenfalls. HINWEIS: Mit der besten Blumen Bühne ist von entscheidender Bedeutung und wird in der Diskussion beschrieben. Verwenden Sie die Hauptgeschäftsstelle der Anlage für die experimentelle Behandlung, wie es produziert mehr Blumen als die Seitenzweige. Verwenden Sie die Seitenzweige entweder als Kontrollen (nicht getaucht werden) oder für andere experimentelle Behandlungen. Alternativ können Sie die Haupt- und Nebenzweige derelbe Anlage für die experimentelle Behandlung und eine andere Anlage als Kontrolle oder für andere experimentelle Behandlungen. Verwenden Sie Etiketten auf einzelne Branchen und einzelnen Blüten mit dem Datum und Art der Behandlung zu markieren. 2. Klonierung und Transformation in Escherichia coli (E. coli) Zellen Klonen des Fragments / Gen von Interesse in die multiple Klonierungsstelle eines Pflanzen binären Vektor, der die T-DNA. Führen Klonierung in einem Schritt oder in zwei Schritten. Direkt klonen kleine Einsätze in diesem Protokoll (~ 500 bp) in die Anlage binären Vektor. In diesem Protokoll, verwenden Sie die Anlage binären Vektor (PRI909). Ansonsten benutzen Sie keine anderen Pflanzen binären Vektoren in einer ähnlichen Strategie. Alternativ klonen große Einsätze (≥6.5 kb) in zwei Schritten: Zuerst mit einem allgemeinen kommerziellen Klonierungskit (nicht pflanzen spezifisch), dann in die Anlage Binärvektor subklonieren. Richten Sie eine PCR reaction, das Gen von Interesse zu amplifizieren. Design der Primer mit Restriktionsschnittstellen am 5'-Ende (gemäß der Mehrfach-Klonierungsstelle des Pflanzen binären Vektor in Gebrauch). Durchführen einer Standard-PCR unter Verwendung genomischer DNA Flachs mit den folgenden Zyklusbedingungen: eine erste Halte von 24 ° C und dann 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 98ºC für 5 s, 60 ° C für 15 sec, und 72 ° C für 2 min. Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 5 min, gefolgt von einem unbestimmte Zeit bei 4 ° C. Separate PCR-Produkte auf 1% Tris / Borat / EDTA (TBE) Agarose-Gel, führen Sie das Gel bei 100 V für 1 Stunde. Reinige die Produkte aus dem Gel und Quantifizierung über Nanodrop. Einrichten des Ligierungsgemisch, das PCR-Produkt in der kommerziellen Klonierungsvektor zu klonieren. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. Wandeln Sie die Ligationsmischung in chemisch kompetente E. coli-Zellen wie folgt. Add 2 ul der Ligationsmischung in eine Durchstechflasche chemically kompetente E. coli-Zellen. Inkubieren auf Eis für 30 min. Hitzeschock der Zellen für 30 sec bei 42 ° C (Wärmeschock Zeit und Temperatur hängt von der Art der verwendeten Zellen). Inkubieren auf Eis und fügen Sie 250 ul RT SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium. Das Röhrchen und Inkubation in einem Orbitalschüttler bei 200 Upm bei 37 ° C für eine Stunde. Verbreiten 10-50 ul von jeder Transformation an eine vorgewärmte LB-Platte (bei 37 ° C vorgewärmt) + geeigneten selektiven Antibiotikums (Bestimmung der selektiven Antibiotikum auf der Grundlage des Typs von kommerziellen Klonierungsvektor). Inkubiere Platten bei 37 ° CO / N. Wählen ~ 10 Kolonien für Mini-prep Plasmidreinigung, Verwendung eines kommerziellen Kits. Mini prep Plasmidreinigung ist in der Regel wie folgt durchgeführt. HINWEIS: Puffernamen sind spezifisch für den kommerziellen Kits verwendet, aber ihre allgemeine Funktionen sind ähnlich. Impfen Sie die einzelnen Kolonien in 2- 5 ml LB-Medium, das die geeigneten selektiven Antibiotikums (bestimmt basierend auf dem Typ der kommerziellen Vektor verwendet). Inkubieren für ungefähr 8 Stunden bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln (~ 300 rpm). Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min. Das Pellet in 250 ul Resuspensionspuffer. Mischen Sie und Wirbel um das Pellet vollständig zerstreuen. Lyse der Bakterienzellen durch Zugabe von 250 & mgr; l des Lysepuffers, gründlich durch Umdrehen der Röhrchen 4-6 mal. Neutralisieren des Lysats in der Neutralisationspuffer und Invertzucker 4-6 mal zu mischen. Zentrifuge für 10 min bei ~ 17.900 xg auf einer Tischmikrozentrifuge. Die Überstände aus dem vorherigen Schritt zu einer Spin-Säule. Zentrifuge wieder bei ~ 17.900 g für 30 bis 60 Sekunden. 60 Sekunden – durch Zugabe von 0,75 ml Waschpuffer und Zentrifuge für 30 Waschen Sie die Spin-Säule. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Zentrifuge für eine zusätzliche 1 min bis remove Waschpufferrückstände. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zum Eluieren der DNA 50 ul Wasser in die Mitte der einzelnen Spalten. Lassen Sie stehen für 1 min, und Zentrifuge für 1 min. 3. Analysieren Sie den gereinigten Plasmide für die Anwesenheit von Insert Restriktionsverdau: Einrichten eines Restriktionsverdaus, um die Anwesenheit des Inserts durch Verdau des Plasmids mit Restriktionsenzymen verwendet, um den Einsatz zu klonieren bestimmen. Eine typische Doppel Restriktionsverdau Reaktion wie folgt: 1 & mgr; g von gereinigtem Plasmid, 1 ul jeder Restriktionsenzymen, 2 ul 10x Restriktionsverdauungspuffer + 2 & mgr; l BSA (falls zutreffend), X & mgr; l Wasser (auf insgesamt 20 & mgr; l) Vorsichtig mischen und inkubieren Sie bei empfohlene Temperatur (variiert von einem Enzym zu einem anderen). Analysieren Sie die Restriktionsverdau Reaktion auf 1% TBE-Agarose-Gel, bei 100 V für 1 Stunde laufen und suchen Sie drop-out von geeigneter Größe. PCR-Analyse: Einrichten einer PCR mit dem gereinigten Plasmid unter Verwendung von Primern aus dem kommerziellen Vektor Region im Inneren des Einsatzes oder der Verbindungsstelle zwischen dem Vektor und dem Insert zu amplifizieren. Gemeinsame Primer M13 Vorwärts- und Rückwärts und T3 / T7 Primer. In diesem Protokoll, die folgenden PCR-Zyklusbedingungen: eine erste Halte von 24 ° C und dann 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 18 Zyklen bei 98 ° C für 5 Sekunden, 60 ° C für 15 sec, und 72 ° C für 2 min. Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 5 min, gefolgt von einem unbestimmte Zeit bei 4 ° C. Last PCR-Produkte auf einem 1% TBE Agarosegel und 100 laufen – 120 V für 1 Stunde. Sequenzierung: Senden Sie die gereinigte Plasmid-Sequenzierung zu einem kommerziellen Anlage zu analysieren und bestätigen die Anwesenheit des Inserts. Sobald das korrekte Konstrukt erhalten wird, diese für den zweiten Schritt der Klonierung (in die Anlage binären Vektor). Hinweis: Die Schritte 2,3-3,3können eliminiert werden, wenn die Klonierung in einem Schritt durchgeführt. 4. Klonierung in die Pflanzen Binary Vector (PRI909) und E. coli Transformation Einrichten eines Doppel Restriktionsverdau Reaktionen auf die Pflanze binären Vektor zu linearisieren und zu isolieren, das zuvor klonierte Insert unter Verwendung der gleichen Restriktionsenzymstellen, die zu den Primern (Schritt 2.2) zugegeben. Analysieren Sie die Restriktionsverdaus mittels Gelelektrophorese, bei 100 V für 1 ausgeführt – 2 Std. Schneiden des Einsatzes und des lineaPflanzen binären Vektor aus dem Gel. Verwenden eines kommerziellen Kits, um die Gel-Produkte zu reinigen. Siehe Wartungshandbuchs. Einrichten einer Ligationsreaktion, um den Einsatz in die Pflanze binären Vektor zu ligieren. Das Insert in Vektor-Verhältnis hängt von der Größe des Einsatzes und der Pflanze binären Vektor. In diesem Protokoll war die LIS1 Einsatz 6,5 kb und die Pflanze Binärvektor betrug 9 kb. So verwenden Sie eine 1: 2-Einsatz auf Vektor Verhältnis. <li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4 bis 3 für die bakterielle Transformation Plasmid-Reinigung und Analyse. Sobald die korrekte Konstrukt (Einsatz + Pflanzen binären Vektor) erhalten wird, an die Elektroporation in Schritt 5 fortfahren. 5. Die Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens Elektrisch Competent Cells Tauwetter ein Fläschchen von Agrobakterium tumefaciens elektrisch kompetente Zellen auf Eis. 1 ng binären Vektor Plasmid-DNA und 20 ul kompetenter Zellen, auf Eis, und vorsichtig mischen. Kühlen Sie ein 0,1 cm Elektroporationsküvette auf Eis. Übertragen Sie die kompetente Zelle / DNA-Mischung zu den Elektroporationsküvetten, und tippen Sie auf, um die Mischung am Boden zu sammeln. Setzen der Küvette im Elektroporator Maschine Impulses (Spannung und Zeit hängen von der Größe der Küvette und dem verwendeten Elektroporator). Zugabe von 1 ml SOC-Medien und Übertragungszellen in ein 15 ml Röhrchen. Inkubieren für 1 h bei 28 bis 30° C, bei 100 Umdrehungen pro Minute schütteln. Teller von 50 bis 100 & mgr; l der Zellen auf LB-Agar + geeigneten selektiven Antibiotikums (abhängig von dem Anlagen binären Plasmids und der Stamm von Agrobacterium verwendet In diesem Protokoll Verwendung 50 ug / ml Kanamycin und 100 ug / ml Streptomycin.). Inkubiere die Platten bis zu 48 h bei 28 – 30 ° C. Wiederholen Sie Schritt 2.5 für Kolonieselektion und Plasmidreinigung. Schritt 3, um das Plasmid zu analysieren und um die Integrität des Einsatzes und T-DNA vor der Verwendung des Konstrukts für Blumentauch überprüfen. Wiederholen Sie Schritt 3.2, unter Verwendung mehrerer PCR-Primer, der im gesamten Einsatzbereich und für die T-DNA-Bereiche und durch Sequenzieren wie in Schritt 3.3. HINWEIS: In diesem Protokoll 4 verschiedene Primer wurden für die T-DNA und 10 Primer in der Einlage ausgebildet ist. Sobald das Vorhandensein von Pflanzen Binärplasmid im ausgewählten Agrobacterium Kolonie wird bestätigt, Ortszellen in 50% Glycerin und bei -80 ° C. Speicher verbleibenden Kolonien auf der Platte bei 4 ° C, wenn sie sich innerhalb einer Woche 7 verwendet werden sollen. 6. Floral-Dipping HINWEIS: 2 Tage vor der blumig-Tauchen: Wachsen Agrobacterium Zellen der stationären Phase (OD 600 zwischen 0,5 bis 1 ist annehmbar) in LB + Antibiotika in geeigneten flüssigen Medien. ANMERKUNG: Dies sind die gleichen Antibiotika wie im Schritt 5.6, bezogen auf die Pflanzen binären Vektor und dem Typ des Agrobacterium-Stamm verwendet. Starten der Kultur mit 1: 100-Verdünnungen von einer gesättigten (5 ml) O / N-Kultur wachsen und für 24 – 48 h bei 28-30 ° C unter Schütteln bei 150 rpm. Die Kultur sollte die midlogarithmic Phase erreicht haben und wahrscheinlicher werden nähern oder stationären Phase 1. OD von etwa 0,8 (wieder OD zwischen 0,5 bis 1 sind alle annehmbar) 8. Sammle die Zellen durch Zentrifugieren bei 5.000 xg bei RT. Die Zellen in Infiltrationsmedium (5,0% Sucrose + 0,05 bis 0,003% Silwet L-77). Für die erste Runde des Eintauchens, verwenden Sie 0,05% Silwet-77. Für die zweite und dritte Runde, ist die Konzentration auf 0,03% (in der Diskussion beschrieben). Fahren Sie mit der Blumentauchschritt. Legen Sie die Anlage auf die Seite und tauchen nur die sichtbaren Knospen in der Infiltrationsmedium für 1-2 min. Lassen Sie die Anlage auf die Seite, und decken Sie es mit Plastikfolie mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Kuppel (Bild 3) zu erhalten. Am nächsten Tag, setzen Sie die Anlage in einer aufrechten Position und in der Regel erhalten. Wenn die Knospe größer wird (in der Regel nach etwa 10 bis 14 Tage), wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,4. Reduzieren Sie die Eintauchzeit auf 30 bis 60 sec und Silwet-77-Konzentration auf 0,003%. Pflegen Sie die Pflanzen in der Regel bis zu ihrem Samen sind reif und bereit, gesammelt werden (Abbildung 4). 7. Auswahl Positive Transformants mit Direct PCR Säen Sie die T1-Samen auf den Boden, wie in Schritt 1.1. Alternativ machen Murashige und Skoog basalen Salzmedium (MS-Medium) durch Zugabe von 2,2 g MS-Medium + 4 g Agar-Agar in 500 ml Wasser. Autoklavieren und gießen Sie in kleinen Pflanztöpfen. Halten Sie in der 4 ° C bis zur Verwendung. Säen Sie den Samen, indem sie auf der verfestigten MS-Medium. Halten Sie im Rahmen lang Tageslicht (14 Stunden Licht und 10 h Dunkelheit). 6 Tage (Figur 5) – Samen wird in etwa 4 keimen. Verwenden Sie eine Saatgut aus jeder Blume als Ausgangspunkt. Wenn keine positive Transformante erhalten wird, wiederholen Sie diesen Schritt durch Auswahl einen anderen Samen aus der Blüte. Hinweis: Testen Sie verschiedene Samen aus den gleichen Blumen, weil in einigen Fällen nicht alle Samen von einer Blume verwandelt werden. Auswahl zusätzlicher Samen aus experimentellen Blüten ist manchmal notwendig. Überprüfen Sie auf der Sämlinge regelmäßig. In etwa 10 bis 14 Tage nach der Keimung, wenn wahrBlätter entwickeln, testen Sie die Pflanzen mit direkter PCR. Bereiten Sie das Blatt DNA-Extrakt, indem 2-3 Blätter (5-10 mg Gewicht) von jedem Keimling und legen Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen 180 ul 50 mM NaOH zu jedem Röhrchen und Inkubation für 10 min bei 95 ° C. Neutralisieren des Extrakts durch Zugabe von 20 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Verwenden 1 ul des Extraktes in der direkten PCR-Reaktion unter Verwendung von Primern für die T-DNA oder dem Einsatz (7) ausgebildet ist, um positive Transformanten ausgewählt. In diesem Protokoll verwenden direkte PCR mit einem anfänglichen Halten bei 24 ° C und dann 2 min bei 98 ° C, gefolgt von 40 Zyklen (98 ° C für 10 sec, Glühschritt für 15 sec, und einem Extensionsschritt bei 68 ° C). Durchführen einer abschließenden Extensionsschritt bei 68 ° C für 5 min, gefolgt von einer unbestimmten Halten bei 4 ° C. (Siehe Tabelle 1 für weitere Einzelheiten auf Grundierungen, Glühtemperaturen und Verlängerungszeiten für die Zyklen). Identifizieren positive Transformanten und wachsen sie bis zur Endfälligkeit. Wenn die Samen wurden in MS-Medium, Transplantation in den Boden in einem größeren Topf gekeimt (Abbildung 5).