亚麻花香浸改造（<em>亚麻</em>）生成的转基因后代具有高转化率

1.成长的植物前6周浸渍，填补5寸盆带土和母猪亚麻种子¼在土壤英寸深（每盆4种子）。一定要坚定了土超的种子。定期给植物浇水，保持它们长日照（14小时光照和10小时黑暗）。 检查植物定期为基层花序（花簇“器官）。的植物都准备用于转化时，芽是可见的，刚刚形成在花序（ 图1和2）。看芽，必要时切断周围的树叶。 注意：使用最好的花期是至关重要的，并在讨论中详细说明。 使用植物的主要分支，因为它会产生更多的花比侧设有分公司的实验性治疗。使用侧分支或者作为对照组（不被浸渍），或用于其它实验处理。 或者，使用的主，侧枝同一种植物的实验性治疗，并使用另一种植物作为控制或其他实验性治疗。使用标签来标记各个分支和日期和治疗型个人花。 2.克隆和转化的大肠杆菌 （ 大肠杆菌 ）细胞克隆感兴趣的片段/小基因导入植物二元载体携带在T-DNA的多克隆位点。 在一个步骤或两个步骤进行克隆。 直接克隆小刀片在这个协议（〜500 bp）的进厂二元矢量。在这个协议中，使用植物双载体（PRI909）。否则，使用任何其他植物的二元载体类似的策略。 可替代地，克隆的大插入物（≥6.5KB）在两个步骤：首先使用一般商业克隆试剂盒（未种植特定的），然后亚克隆到植物二元载体。 设立的PCR REAC灰以扩增感兴趣的基因。设计的引物在5'端的限制性位点（根据所使用的植物二元载体的多克隆位点）。 使用标准的PCR基因组DNA的亚麻执行与以下循环条件：24℃的初始保持，然后2分钟，在94℃，随后在98℃的30个循环持续5秒，60℃15秒，并72℃2分钟。在72℃进行5分钟，随后无限期保持在4℃下进行最后的延伸步骤。 于1％的Tris /硼酸盐/ EDTA（TBE）琼脂糖凝胶上分离PCR产物，运行在100伏的凝胶1小时。从凝胶中纯化的产物，并通过的NanoDrop量化。 建立连接混合物克隆PCR产物在商业克隆载体中。按照制造商的协议。 变换连接混合物进化学感受态大肠杆菌细胞如下。 添加2微升的连接混合物的进入通道中的一个小瓶emically主管E.大肠杆菌细胞。在冰上孵育30分钟。 热休克细胞30秒，在42℃（热休克的时间和温度取决于所使用的细胞类型）。 在冰上，并加入250微升的RT与代谢物阻遏（SOC）中的超级最佳肉汤。 盖上管并以200rpm孵育在轨道摇床在37℃下1小时。 蔓延10 – 从上一个预热LB平板（预热，在37℃）+适当选择性抗生素每个转化50微升（确定基于使用的商业的克隆载体的类型，选择性抗生素）。孵育板在37°CO / N。 挑〜10个菌落为微型制备质粒纯化，使用商业试剂盒。赠送制备质粒纯化通常进行如下。 注：缓冲区名特定使用的商业工具包，但他们的一般功能是相似的。 在接种2的单菌落- 5ml的LB含有适当选择性抗生素（确定基于所使用的商业载体的类型）平台。 孵育约8小时，在37℃剧烈振荡（〜300 RPM）。 收获细胞，离心，在6000×g离心10分钟。 悬浮在250微升悬浮缓冲沉淀。混合和涡旋以完全分散的颗粒。 6次 – 裂解的细菌细胞中加入250微升裂解缓冲液中，通过反相管4调匀。 中和裂解物中的中和缓冲液并倒转4 – 6次以混合。离心在〜17900 XG 10分钟在台式离心。 从前面的步骤，一个离心柱转移上清液。离心机再次〜17900 XG为30 – 60秒。 60秒 – 通过增加0.75毫升洗涤液和离心机30冲洗离心柱。丢弃的流量通过。 离心机额外1分钟至字符型已经残留洗涤液。将离心柱在一个干净的1.5ml微量管中。为了洗脱DNA，加50微升水中，每列的中央。静置1分钟，并离心1分钟。 3.分析了纯化的质粒为插入体的存在限制精华： 设置一个限制性消化消化与用于克隆的插入物的限制性内切酶的质粒以确定插入物的存在。一个典型的双限制性消化反应如下：1微克纯化的质粒，1μl的各限制酶，2微升10X限制性消化缓冲液+ 2微升BSA（如果适用的话）中，X微升水（总共20微升） 轻轻混匀，并培育在推荐的温度（从一个不同的酶另一个）。 分析限制性酶切1％TBE琼脂糖凝胶反应，在100 V 1小时运行，并寻找辍学了适当的大小。 PCR分析： 设立的PCR与纯化的质粒，使用引物从商用矢量区域以扩增插入物或载体和插入件之间的交界处的内部。通用引物是M13正向和反向和T3 / T7引物。 在这个协议中，使用下面的PCR循环条件为：24℃，然后用2分钟，在94℃，随后18个循环的98℃下5秒，60℃15秒和72℃的初始保持2分钟。在72℃进行5分钟，随后无限期保持在4℃下进行最后的延伸步骤。 在1％TBE琼脂糖凝胶负载的PCR产物和运行为100 – 120伏1小时。 排序： 发送纯化质粒到商业测序工具来分析和确认插入物的存在。 一旦获得正确的构建物，将其用于克隆的第二个步骤（到植物二元载体）。 注意： 步骤2.3 – 3.3如果克隆是在一个步骤中完成的，可以消除。 4.克隆到植物双元载体（PRI909）和E.大肠杆菌转化设置一个双限制性消化反应线性化植物二元载体，并使用加入到引物（ 步骤2.2）的相同限制性酶位点隔离先前克隆的插入物。 分析使用凝胶电泳，100 V 1运行限制性消化 – 2小时。切割插入物，并从该凝胶线性植物二元载体。 使用商业试剂盒来纯化的凝胶产品。参阅制造商的手册。 建立一个连接反应结扎插入到植物二元载体。插入到载体的比例取决于该插入件的尺寸和植物二元载体。在这个协议中的LIS1插入了6.5 kb和植物二元矢量是9 KB。因此，用1：2插入到载体比例。 <li>重复步骤2.4 – 3的细菌转化，质粒纯化和分析。一旦获得正确的构建物（插入+植物二元载体），则继续执行电穿孔，在步骤5。 5.电穿孔进入农杆菌电感受态细胞解冻的农杆菌的小瓶农杆菌电感受态细胞在冰上。 添加1纳克的二元载体质粒DNA到20微升感受态细胞，冰，轻轻混匀。 冰浴一0.1厘米电比色皿。 主管细胞/ DNA混合物转移到电试管，挖掘，收集底部混合物。放的反应杯在电穿孔机和脉冲（电压和时间条件取决于反应杯的大小和所使用的电穿孔）。 加入1毫升SOC培养基和转移细胞到15ml管中。 孵育1小时，在28 – 30°C，晃动在100转。板50 – 100微升细胞在LB琼脂+适当选择性抗生素的（取决于植物二元质粒和农杆菌中使用的菌株在这个协议中使用50μg/ ml的卡那霉素和100μg/ ml链霉素）。 孵育平板达48小时，在28 – 30℃。 菌落选择和质粒纯化重复步骤2.5。 重复步骤3来分析的质粒，并使用该构建为花饰-浸渍之前，必须检查插入物和T-DNA的完整性。重复步骤3.2，在整个插入区域和整个T-DNA区和通过测序使用多个PCR引物如在步骤3.3。 注意：在这个协议中4种不同的引物，在整个T-DNA以及横跨刀片10的引物而设计的。 一旦在选定的农杆菌菌落植物二元质粒的存在得到确认，地方小区iñ50％甘油，并储存在-80℃。商店剩余菌落在板在4℃下，如果它们被一个7星期内使用。 6.花倾注：前2天，花卉浸渍： 成长农杆菌细胞至平稳期（OD 600 0.5 – 1是可接受的）在LB +适当的抗生素在液体介质。 注意：这些是相同的抗生素如在步骤5.6，基于植物的二元载体和所用的农杆菌菌株的类型。 开始培养以1：100稀释的饱和（5毫升）中的O / N培养并生长24 – 48小时，在28-30℃下以150rpm摇动。培养应已达到midlogarithmic相位和更可能会接近或在静止的阶段1。大约0.8 OD（0.5比1再度OD都可以接受）8。离心在5,000×收集细胞在RT克。 悬浮细胞浸润在培养基（5.0％蔗糖+ 0.05 – 0.003％的Silwet L-77）。对于第一轮浸泡，用0.05％的Silwet-77。对于第二轮和第三轮，减低浓度至0.03％（以讨论详述）。 继续花香浸一步。莱在其一侧的工厂，并在渗透中1-2分钟只沾可见芽。离开植物在其一侧并用保鲜膜覆盖它，以保持高湿度的圆顶（ 图3）。 第二天，将植物在直立位置和正常维护。 当芽变大（通常在约10 – 14天），重复步骤6.1 – 6.4。减少浸渍时间30 – 60秒的Silwet-77浓度为0.003％。 维持厂一般直到它们的种子成熟，并准备被收集（ 图4）。 7.选择积极的茶nsformants与直接PCR 母猪在土壤中的T1种子按照步骤1.1。 可替代地，通过将​​2.2克的MS培养基+4克琼脂在500ml水中使Murashige和Skoog基础盐培养基（MS培养基）。高压釜中，倒入小花盆。保持在4℃直至使用。 通过将其放在凝固MS培养基上播下种子。不断长日照（14小时光照和10小时黑暗）。种子将发芽在大约4 – 6天（ 图5）。 从每朵花为出发点，用一个种子。如果没有获得阳性转化体，通过拾取从花另一个种子重复此步骤。 注：从同花测试不同的种子，因为在某些情况下，不能从一朵花所有的种子将被改造。从实验的花选择附加种子有时是必要的。 检查定期苗。在大约10 – 发芽后14天，当真实的离开发展，直接PCR测试工厂。 3叶 – 通过削减2准备的叶提取物的DNA – 从每苗（5毫克10重量），并放置在离心管。 加入180微升的50mM的NaOH到每个管中，并孵育10分钟，在95℃下。 通过加入20微升的1M的Tris-HCl（pH 8.0）中的中和的提取物。 使用1微升提取物中的直接PCR反应中，使用在整个T-DNA或插入（ 图7）设计的引物，以选择阳性转化体。 在这个协议中，使用直接PCR为24℃的最初的保持，然后2分钟，在98℃，随后的（98℃40个循环持续10秒，15秒的退火步骤，并在68℃的延伸步骤C）。在68℃下5分钟，随后无限期保持在4℃下进行最后的延伸步骤。 （参考表1的详细信息，引物，退火温度和延长时间周期）。 确定阳性转化和他们成长到成熟。如果种子发芽，在MS培养基中，移植到土壤中一个更大的锅（ 图5）。