Атомно-силовая микроскопия красных фонарей фоторецепторов Использование Mapping PeakForce Количественный Наномеханические недвижимости
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) использует кончик пирамидальную прикрепленный к консоли для исследования силы реакции поверхности. Отклонения от кончика может быть измерена до ~ 10 PN с помощью лазера и детектора секторной, которые могут быть преобразованы в изображение топографии. Амплитудной модуляции или "режим нажатием" АСМ включает в себя зонд, делая прерывистый контакт с поверхностью, колеблясь на своей резонансной частоте, чтобы произвести изображение. При использовании в сочетании с жидкостью камере, нажав режима АСМ позволяет томографии биологических макромолекул, таких как белки в физиологически соответствующих условиях. Нажатие режиме АСМ требуется ручной настройки зонда и частых корректировок множества параметров сканирования, которые могут быть сложными для неопытных пользователей. Для получения высококачественных изображений, эти корректировки наиболее трудоемким.
PeakForce Количественный Наномеханические Сопоставление свойств (PF-QNM) создает изображение путем измерения силы responсебе кривая для каждой точки контакта с образцом. С ScanAsyst программного обеспечения, PF-QNM могут быть автоматизированы. Это программное обеспечение регулирует уставки, частоты вращения, скорости сканирования, прирост, и другие важные параметры сканирования автоматически для данного образца. Мало того, что этот процесс защиты как хрупкие зондов и образцов, это значительно сокращает время, необходимое для получения изображений с высоким разрешением. PF-QNM совместим для АСМ изображений в жидкости; Поэтому, он имеет широкое применение для визуализации биологически соответствующие материалы.
Метод, представленный в этой статье описывается применение ПФ-QNM получать изображения бактериальной красных фонарей фоторецепторов, RpBphP3 (P3), от фотосинтеза R. болотный в свет адаптированы государства. С помощью этого метода, отдельные белковые димеры Р3 и агрегаты димеров были обнаружены на поверхности слюды в присутствии буфера визуализации. С соответствующими корректировками в поверхностные и / или концентрации раствора, этот методкак правило, может быть применено к другим биологически соответствующих макромолекул и мягких материалов.
Introduction
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) стал очень важным инструментом для исследования структурных и механических свойств поверхностей, тонких пленок и одиночных молекул с момента ее изобретения в 1986 году (Рисунок 1). 1-3 Использование жидкого-клетку, метод имеет становятся особенно полезно при исследовании биологических макромолекул, и даже живых клеток в физиологически соответствующей среде. 4-10 Нажатие режиме АСМ традиционно используется для визуализации мягких материалов или слабо связанные молекулы на поверхность, так как в контактном режиме АСМ, как правило, непригодны вследствие чтобы ущерб, причиненный боковых сил, действующих на образце кантилевера. 11 Нажатие режиме АСМ существенно снижает эти силы, имея верхушка периодически прикасайтесь к поверхности, а не находясь в постоянном контакте. В этом режиме кантилевер колебались в или около его резонансной частоты, нормальном к поверхности. Аналогично связаться-режим АСМ, топография аналyzed путем построения движение г-пьезо как функция ху (расстояние).
Динамика консольные может быть довольно нестабильным на или вблизи резонанса; Поэтому, они очень сложной для автоматизации пределами "стационарном" ситуации. В частности, эта динамика зависят как от свойств образца и среды сканирования. Для мягкой молекулы, адсорбированной на жесткий (ER) поверхности, хорошо настроенный контур обратной связи для молекулы может привести к обратной колебаний на поверхности. Работа в жидкости дальнейшего усложняет настройку консоли. Изменения в уровнях температуры или жидкости требуют постоянного корректировку уставки, прибыли и других показателей визуализации. Эти корректировки, как правило, очень много времени и сложной для пользователей.
Пиковое усилие Количественный Наномеханические Сопоставление свойств (PF-QNM), как кратковременное нажатие АСМ, позволяет избежать латеральных взаимодействий на периодически контактирование образца (рисунок 2). 12-15 </ SUP> Однако, ПФ-QNM работает в не-резонансном режиме и частотах, значительно меньших, чем нажав режиме АСМ. Это исключает проблемы настройки нажав режиме AFM, в частности, усугубляется при наличии жидкости. С PF-QNM, изображения собраны, взяв кривую силы в каждой точке контакта. С добавлением ScanAsyst программного обеспечения, 15 регулировка параметров сканирования могут быть автоматизированы и изображения с высоким разрешением получены в считанные минуты с помощью даже неопытным пользователям. После того, как пользователь становится больше знакомы с АСМ, некоторые или все из автоматизированных параметров может быть отключена в любой момент, который позволяет экспериментаторам, чтобы точно настроить качество изображения вручную. С момента своего создания, PF-QNM была применена для сопоставления бактериородопсин, мембранный белок, и другие родные белки в субмолекулярном уровне. 16-18 Для бактериородопсине, существует прямая корреляция между гибкостью белка и рентгеновской кристаллографии структур. 12 PF -QnM был использован для исследования живых клеток с высоким разрешением. 19,20 Кроме того, данные PF-QNM уже выяснены важные связи между структурой и механики в мембране эритроцитов, что имеют решающее значение для целостности и функции клеток. +21
Мы использовали сканирующей зондовой микроскопии методы (SPM), 22 в том числе AFM, 23 изучать структуру красных фонарей фоторецепторов названием bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Они состоят из светового модуля зондирования, ковалентно связанной с сигнализации-эффекторной модуля такой как гистидинкиназа (HK). 26 Световой модуль зондирования обычно содержит билин хромофора, которая подвергается структурной трансформации при поглощении фотона, с серией структурных изменений, достигающих модуль сигнализации-эффекторной и ведущих к глобальной трансформации всей белка . 24,27-29 На основе этой трансформации, есть два различных светопоглощающий сTates из BphPs, красной и дальней красной света поглощая государства, обозначается как Pr и ПФР. Pr термически стабилен, адаптируются к темноте состояние для большинства BphPs. 28 Молекулярные основы Pr / Pfr фотопреобразования не совсем понял ввиду ограниченности структурного знания этих белков. За исключением одной структуры из D. radiodurans, 30 все опубликованные рентгеноструктурного структуры этих белков являются в темно-адаптированы состоянии и не имеют домен эффектора. Интактные BphPs слишком велики, чтобы быть эффективно исследованы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и, как известно, трудно кристаллизуются в их интактной форме (особенно в легкой приспособлены государства) для рентгеновской кристаллографии. BphPs недавно были разработаны как белковых маркеров инфракрасный люминесцентных (IFP ы). 31 Структурная характеристика этих белков может далее помощь в эффективной IFP дизайна. 32-36
В центре внимания этой статьи является представление процедурувизуализация BphPs использованием жидкого клеток AFM через PF-QNM. Метод свидетельствуют исследования, светового приспособлены состояния bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) от фотосинтетических бактерий Р. болотный. Процедура АСМ, представленные здесь, удобный и простой подход для визуализации белков, а также другие биологические макромолекулы. С помощью этого метода, конструктивные детали из отдельных молекул могут быть собраны в течение короткого периода времени, аналогичного к научно-лабораторного курса сеанса верхнего уровня. Через измерения сечений и комплектующих дальнейшие размерные анализы, экспериментальные данные можно сравнить с полезных вычислительных моделей. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
АСМ является сканирующий зондовый метод микроскопии в полной мере способны визуализации белков и других биологических макромолекул в физиологически соответствующих условиях. По сравнению с рентгеновской кристаллографии и ЯМР, одно ограничение АСМ является его неспособность достич…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Программа NSF-МРТ (CHE: 1229103) признается для финансирования покупки новых управляющей электроникой, программное обеспечение, жидких клеток, и другое оборудование, необходимое для сборки двойную AFM / STM. Мы признаем, общие удобства в университете программы Чикаго NSF-MRSEC (DMR-0820054) для помощи с АСМ-измерительных приборов, обучение и изображений, а также для приборам предоставляться научно-исследовательские центры сети материалов (DMR-0820054). Мы особенно благодарим доктора Qiti Го, д-р Джастин Jureller, и профессор Ка Йи Ли за приветствуя наших студентов до финансирования предложения NSF-МРТ, которая принесла все необходимое оборудование, чтобы наш кампус. Мы признаем, финансирование из STEM гранта Название III (ID: P031C110157) присуждена Северо-Восточного Иллинойского университета, который предоставил летние исследовательские стипендии для студентов и преподавателей, а также поддержку для расходных материалов. Наконец, мы признаем Bruker-Nano, Inc для продолжения инструментальной поддержки и разрешения по гeproduce график, показывающий механизм PeakForce QNM и использовать слово ScanAsyst описать автоматизированное программное обеспечение.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
