Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer<em> In Vivo</em

OPMERKING: Animal handling en experimenten werden uitgevoerd, zoals goedgekeurd door de universiteit van Göttingen Comité voor Ethiek in de Dierproeven. 1. Voorbereiding van Instrumenten en Pipette Fabrication Zorg ervoor dat de elektroporatie setup bestaat uit een stereomicroscoop met grote werkafstand en is uitgerust met TL verlichting en filter sets voor de gebruikte kleurstof. Voor elektroporatie gebruiken ofwel een speciale cel electroporator of algemene vierkante pulsgenerator aan een oscilloscoop. Sluit de electroporator uitgangen om een ​​pipet houder en een bad elektrode. Sluit de positieve klem van de pulsgenerator de micropipet houder en de minpool aan het bad elektrode. Het zowel de pipet houder en het bad elektrode bevatten zilver draden gecoat met een dunne laag zilver chloride. Monteer de pipet houder op een micromanipulator Exacte positionering mogelijk te maken. </li> Fabriceren elektroporatie micropipetten van borosilicaatglas haarvaten met interne gloeidraad. Gebruik een horizontale micropipet trekker en een gemodificeerd protocol toepassing voor de vervaardiging van pipetten voor patch-clamp experimenten zoals beschreven door Bestman et al. 13. Passen parameters een langere schacht en een kleinere tip opening resulteert in een hogere pipet weerstand van ongeveer 15-20 MOhm voor enkele cel elektroporatie produceren. De pipet weerstand lager moet zijn, bijvoorbeeld 3-4 MOhm voor etikettering van groepen cellen. Meet de pipet weerstand ofwel direct met een speciale single-cell electroporator of berekenen met de wet van Ohm na het meten van stroom met een oscilloscoop na toepassing van een bepaald voltage puls. 2. Bereiding van Electroporation Solution Ontbinden-fluorofoor gekoppeld dextran in frog beltoon (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl 2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvaat, 10 mM HEPES, pH 7,8, osmolariteit was 230 mOsmol / l) bij een concentratie van 3 mM. De cellen kunnen niet zo helder worden geëtiketteerd als lagere kleurstof concentraties worden gebruikt. Bereid een groot volume stockoplossing en verdeel het in kleine porties. Bevriezen ze voor opslag (stabiel gedurende maanden). OPMERKING: Dextranen zijn verkrijgbaar in verschillende maten en een verscheidenheid van de emissie / excitatiespectra (bv, Alexa 488-dextran 10 kD, Alexa 546-dextran 10 kD, Alexa 568-dextran 10 kD, Alexa 594-dextran 10 kD, TMR-dextran 3kD.). Backfill de micropipet met een langwerpige pipetpunt met een kleine hoeveelheid dextran oplossing (1-5 ul). Flick zorgvuldig de micropipet met de vinger om de resterende luchtbellen uit de pipet tip verwijderen. Monteer de micropipet in de pipet houder. Zorg ervoor dat de zilverdraad in de pipet in contact met de kleurstofoplossing. 3. Selectie van larvale X. laevis </ Em> Gebruik albino larven van X. laevis voor de experimenten. Wildtype dieren bezitten-pigment gevulde melanoforen dat autofluorescentie-emissie tijdens confocale / multiphoton beeldvorming tonen en zijn daarom niet geschikt voor de beschreven experimenten. Stage premetamorphotic kikkervisjes na Nieuwkoop en Faber 14. Selecteer kikkervisjes trappen 45-53 voor de experimenten. 4. Elektroporatie van fluorofoor-gekoppelde dextranen Leg een klein stukje weefsel in een petrischaal en bedekken met een kleine hoeveelheid water die 0,02% tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat, pH 7). Verdoven van de kikkervisjes in water met 0,02% tricaïne. Na enkele minuten de dieren ophouden te bewegen. Bevestig de juiste verdoving door het aanraken van kikkervisjes. Ze dienen niet-responsief. Breng zorgvuldig het kikkervisje van de verdoving naar het weefsel bedekt petrischaal. Zorg ervoor dat het bad elektrode sluit de elektroporatie circuit. Zorg dat de elektrode in contact met het vochtige doekje; een direct contact met het kikkervisje is niet noodzakelijk. Plaats de micropipet tip dicht bij het reukorgaan met behulp van de micromanipulator. Doordringen in de huid die de reukorgaan met de pipet en voorzichtig vooruit de tip in de centraal gelegen sensorische neuron laag van de belangrijkste reukepitheel of vomeronasal epitheel. Triggeren positieve vierkante spanningsimpulsen om kleurstof te zetten in sensorische neuronen. Breng een enkele spanningspuls (bijv., 25 V, puls lengte 25 msec) of treinen van meerdere pulsen (bv., 50 V, puls lengte 300 usee, 400 msec trein duur bij 200 Hz). OPMERKING: Bepaal optimale spanningspuls parameters voor de gewenste uitbreiding van de etikettering. Verminder spanning pulsamplitude, duur en het aantal herhalingen van het aantal gelabelde cellen verminderen. Breng hogere spanning pulsamplitude, duur en aantal pulses voor een meer wijdverbreide etikettering. Visualiseer succesvolle kleurstof extrusie en elektroporatie door getriggerd pulsen met fluorescerende verlichting van de stereomicroscoop. De kleurstof verspreidt zich snel in cellichaam en dendrieten na succesvolle elektroporatie. Herhaal de stappen 4,5-4,9 voor de tweede reukorgaan van het kikkervisje. Breng het kikkervisje in een bekerglas gevuld met vers water voor de invordering. Na ca. 5 min van de kikkervisjes ontwaken uit narcose en het normale zwembewegingen. Na 24 uur de geëlectroporeerd kleurstof verspreidt zich in de sensorische neuronen en bereikt uiteindelijk het reukorgaan via axonale transport. 5. Montage Dieren voor in vivo visualisatie van cellen en Axonale Processen Verdoven van de kikkervisjes in water met 0,02% tricaïne. Zorgvuldig overdragen kikkervisjes in een imaging kamer, bijvoorbeeld, een kleine siliconen rubber bedekte petrischaal met een kikkervisje-sized uitsparing. </ Li> Snij een kleine rechthoek in een streep van Parafilm. Bedek het kikkervisje met de Parafilm, waardoor de voorste telencephalon blootgesteld via de cut-out-venster. Bevestig de Parafilm met naalden op de schotel zonder verwonden het kikkervisje. Zorg ervoor dat het kikkervisje is ondergedompeld in voldoende water met 0,02% tricaïne. Monteer de beeldvorming kamer op het podium van een rechtopstaande multifoton microscoop of confocale microscoop. Het verwerven van een driedimensionale stapel van beelden van de bulbus olfactorius. Zorg dat de beeldvormende procedure zo kort mogelijk en niet hoger dan 10-15 min. Breng het kikkervisje in gewoon water in een aparte tank en blootstelling te voorkomen aan het licht. Na 5 min, het kikkervisje ontwaakt uit anesthesie. Herhaal de stappen 5,1-5,7 na bepaalde tijdsintervallen, bijv., Elke dag. 6. Montage Dieren voor Ex vivo visualisatie van cellen en Axonale Processen Als alternatief voor sectie 5van het protocol, gebruik een weggesneden hersenen voorbereiding op de gelabelde sensorische neuronen te visualiseren. Verdoven en doden van het kikkervisje door doorsnijding van de hersenen bij de overgang naar het ruggenmerg. Accijnzen een blok van weefsel met daarin de reukorganen, de olfactorische zenuwen en de anterior telencephalon. Breng het weefsel blok naar kikker Ringer-oplossing en verwijder bindweefsel met fijne schaar om de ventrale zijde van de hersenen bloot te leggen. Breng het weefsel blok naar een beeldvorming kamer en zet deze vast met een platina montuur strijkinstrumenten met nylon draden. Monteer de beeldvorming kamer op het podium van een confocale / multifoton microscoop. Het verwerven van een driedimensionale stapel van beelden van de bulbus olfactorius. 7. Beeldverwerking en Data Evaluation Optimaliseren en niet-lokale middel van filtering om de beeldkwaliteit en de visualisatie van de neuronale structuren verbeteren van toepassing zoals beschreven door Coupé, P. et al. 15. LET OP: De gegevens van imaging experimenten in diepere weefsellagen van levende exemplaren zijn vaak luidruchtig. Creëer maximale intensiteit projecties van het beeld stacks voor een overzicht. Voor time-lapse imaging experimenten screenen datasets voor enkele ondubbelzinnig identificeerbaar axonen van sensorische neuronen. Reconstrueren celmorfologie via software-ondersteunde traceren van neuronale processen zoals beschreven door Peng et al. 16.