تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة
Summary
Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.
Abstract
خلايا تستجيب لchemokine التحفيز عن طريق فقدان شكلها جولة في عملية تسمى الاستقطاب، وعن طريق تغيير توطين التحت خلوية من العديد من البروتينات. وقد استخدمت تقنيات التصوير الكلاسيكية لدراسة هذه الظواهر. ومع ذلك، أنها تتطلب اكتساب اليدوي من العديد من الخلايا تليها تستغرق وقتا طويلا الكمي من التشكل وشارك في توطين تلطيخ عشرات الخلايا. هنا، يتم وصف طريقة سريعة وقوية لدراسة هذه الظواهر على عينات تتكون من عدة آلاف من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي التصوير التكنولوجيا التي تجمع بين مزايا المجهر مع تلك من عداد الكريات. استخدام الخلايا الليمفاوية T حفز مع CCL19 وتلطيخ لجزيئات MHC من الدرجة الأولى والأكتين الخيطية، وتقدم استراتيجية النابضة لقياس في وقت واحد درجة التعديلات شكل ومدى التعاون توطين علامات التي تتأثر CCL19 الإشارات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية النابضة سمحت لنا observه الفصل بين الأكتين الخيطية (في الجبهة) وفسفرته Ezrin-Radixin-Moesin (الفوسفات-ERM) البروتينات (في العمق) في خلايا T الاستقطاب بعد التحفيز CXCL12. وكانت هذه التقنية مفيدة لمراقبة تأثير حظر على الاستقطاب من عنصرين مختلفين أيضا: تثبيط الأكتين البلمرة التي كتبها مثبط الدوائية والتعبير عن المسوخ من Par6 / شاذة PKC يشير المسار. وهكذا، يظهر دليل على أن هذه التقنية مفيدة لتحليل كل التعديلات الشكلية وإعادة التوزيع البروتين.
Introduction
كيموكينات هي بروتينات قابلة للذوبان الصغيرة التي تجذب الخلايا لمواقع متخصصة 1. ولذلك، فإنها تشارك في الموضع الصحيح من الخلايا في الأنسجة، وهي وظيفة حاسمة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. الجهاز المناعي ليست استثناء لهذه القاعدة لأنها تعتمد على عمل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل في تناسق لجبل استجابة مناعية فعالة. من خلال التحكم في موقع معين من نوع واحد الخلايا المناعية في حالة معينة، كيموكينات هي المطلوبة مسبقا قبل أن يتم الكشف عن المستضدات الأجنبية وتحييدها.
في الخلايا الليمفاوية T على وجه الخصوص، كيموكينات تربط لمستقبلات محددة السطح والتي، على المشاركة، وانتزاع العديد من الإشارات بين الخلايا (ارتفاع الكالسيوم، ERK الفسفرة، وتفعيل رو GTPases، وزيادة في integrins تقارب وهيكل الخلية التعديلات) التي تفضل T خلية حركية 2،3. على المستوى الخلوي، ويمكن للمرء أن يلاحظ التغيرات المورفولوجية أثار chemokine على التحفيز.هذه التغيرات في الأشكال خلية مثيرة خصوصا في خلايا T: يستريح خلايا T لها مورفولوجيا مستديرة تشبه حبة عند السفر في مجرى الدم. ومع ذلك، فإن الاستشعار عن وجود كيموكينات في مواقع التهابات أو على القرب من الأجهزة اللمفاوية هو الذهاب الى تغيير شكل خلايا T التي تعتمد الآن على "اليد مرآة" مورفولوجيا نموذجية تتكون من شكل ثنائي القطب: حافة الرائدة في الجبهة وميزة زائدة، أو قدم ذنبية، في الجزء الخلفي 4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمكونات داخل الخلايا تفصل في هذه المناطق المعاكس اثنين من خلية T المستقطبة للحفاظ على الهجرة. على سبيل المثال، ويزيد من خيوط الأكتين البلمرة على chemokine التحفيز 5 و الأكتين بلمرة تتراكم في الجزء الأمامي من T خلية الاستقطاب 2. من ناحية أخرى، والعديد من البروتينات، مثل البروتينات فسفرته من Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) الأسرة التي تربط بين غشاء البلازما إلى القشرية الهيكل الخلوي F-الأكتين، وإعادة توطين في قدم ذنبية من الاستقطابخلايا T 6. ومن المثير للاهتمام، نحن وغيرنا قد أظهرت أن هناك حاجة لهذه العملية الاستقطاب T الهجرة الخلية. والواقع أن أي علاج الذي يتداخل مع الاستقطاب تمنع الحركة الخلوية. على سبيل المثال، وتثبيط لنشاط أعضاء من البروتين غير نمطية تحركات C (PKC) أسرة، وكتل PKCζ وPKCι T الاستقطاب الخلية ولها عملية المسح المهاجرة من الخلايا الجذعية 7. وينظم T خلية الاستقطاب أيضا رو GTPases. لقد أظهرنا أن تعديل النشاط RhoA من البروتين Fam65b وصف مؤخرا يتداخل مع التغيرات الخلايا التائية في التشكل وقدرتها على الهجرة في مقايسة Transwell 6. كما الاستقطاب هو خطوة شرط أساسي لحركية الخلوية، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد بأنها قراءات الرئيسية من الردود chemokine. تم إجراء تعديلات شكل خلية قياس سابقا يدويا 8. ومع ذلك، هذا النوع من القياس الكمي هو جدا تستغرق وقتا طويلا، بحيث عادة سوى عدد قليلتؤخذ عشرات الخلايا في الاعتبار.
هنا، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس بسرعة درجة التعديلات شكل من الخلايا الليمفاوية T تتعرض لchemokine التحفيز. تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات) يستخدم، والذي يجمع بين مزايا تدفق عداد الكريات والمجهر 9 لقياس كفاءة كمية من الخلايا الاستقطاب في ظروف مختلفة من التحفيز chemokine. بالإضافة إلى تقدير حجم التعديلات الشكلية التي يمكن للمرء أن قياس بقوة مع هذه التكنولوجيا، فمن الممكن أيضا لتقييم التغيرات في توطين التحت خلوية من بعض البروتينات على chemokine الإشارات.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام تقنية حديثة من تدفق التصوير الخلوي، ووضع استراتيجية النابضة سريعة ومفيدة لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية الناجم عن التحفيز chemokine يرد. من تجربة واحدة، يمكن للمرء الحصول على نوعين رئيسيين من المعلومات: التغييرات في مورفولوجية الخلايا الناجم عن التحفيز chemoki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يعترف كثيرا بيير Bourdoncle، توماس غيلبير ولويز Rimbault مرفق كوشين التصوير. وأيد هذا العمل من قبل INSERM، CNRS والدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (إيكيب labellisée).
Materials
| Name of the material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description (optional) |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
