الكشف عن<em> في الموقع</em> مجمعات البروتين البروتين في<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص
Summary
يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي، وهي جمعية التي سبق تحديدها من خلال المشاركة في مناعي.
Abstract
Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.
Introduction
ذبابة الفاكهة أقراص كبيرة (DLG) هو عضو الحفظ من guanylate كيناز الأسرة المرتبطة غشاء السقالات البروتينات التي تساعد في تنظيم جمعية مجمعات البروتين كبيرة في مواقع محددة من غشاء البلازما. حددت أصلا باعتبارها البروتين القامع الورم، ويخدم DLG كمقياس مهم من الظهارية apicobasal قطبية 1،2،3. يخدم أجهزة … كذلك وحدة نمطية السقالات الرئيسية في الوصل العصبي العضلي (NMJ) من الخلايا العصبية الحركية glutamatergic خلال نمو اليرقات 4. أجهزة … تلعب أدوارا متنوعة في NMJ اليرقات، ويعتمد تعدد النمط الظاهري على قدرته على ربط مع بروتينات متعددة 5،6. واحدة من هذه البروتين هو هو جين تاو لى شاو تاي (HTS)، ونديد إلى adducins الثدييات التي أساسا وصفت في ما يخص دورهم في تنظيم الأكتين-إسبكترن الهيكل الخلوي 7. وقد سبق يتبين أن DLG وHTS يمكن أن تشكل مجمع مع بعضها البعض على أساس في المختبر </م> تجارب شارك في مناعي التي تنطوي على الكبار كله لست] ذبابة 8. عيب واحد من هذه النتائج، ومع ذلك، هو أنها لا تشير إلى هذا حيث أشكال معقدة. مع استخدام المناعية، ويلاحظ توزيعات DLG وHTS إلى التداخل في الغشاء بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات، ولكن هل هم في مجمع في هذه المنطقة 8؟ كما هو مبين في الآونة الأخيرة وأكبر من التفصيل هنا، ويستخدم القرب ربط الفحص (PLA) للبحث عن وجود ارتباط بين الوضع الطبيعي DLG وHTS في خصيصا في اليرقات NMJ 27.
جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية جديدة نسبيا تستخدم في الغالب في الخلايا والأنسجة الثقافة التي يمكن الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الموقع 9. في هذا الاختبار، يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية ضد اثنين من البروتينات في المصالح مع زوج من الأجسام المضادة الثانوية أنواع محددة، ووصف تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، والتي يتم تصريفها إلى أليغنوكليوتيد] (الشكل 1A، B). إذا كان البروتين اثنينالصورة هي على مقربة من بعضها البعض (أي في غضون بضع عشرات من نانومتر)، والمسافة بين تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى المرفقة يمكن سد من خلال التهجين اثنين من [أليغنوكليوتيد موصل إضافية (الشكل 1C). في هذا التشكل، وينتهي خالية من أليغنوكليوتيد] موصل قريبة بما فيه الكفاية لاجراء اتصالات مع بعضها البعض، وجزيء DNA دائرية مغلقة يمكن تشكيلها على ربط في الموضع (1D الشكل). يخدم جزيء DNA دائري كنموذج لفي الموقع التضخيم دائرة المتداول، والذي وتستعد قبل واحدة من [أليغنوكليوتيد مترافق إلى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (الشكل 1E). تسلسل داخل تضخيمها، والمنتج DNA concatemeric الناتجة عندئذ يمكن تصور مع fluorescently المسمى، تحقيقات قليل النوكليوتيد التكميلية (الشكل 1F). منذ يبقى تضخيم الحمض النووي تعلق على واحدة من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، وتوطين التحت خلوية من البروتين البروتين التفاعل داخلهاالأنسجة غ يمكن التأكد بسهولة.
ويشيع استخدام عدة أساليب للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات بما في ذلك تقنيات المختبر مثل شارك في مناعي، وسحب إلى أسفل المقايسات والخميرة فحص يومين الهجين، وتقنيات الجسم الحي مثل نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) وثنائي الجزيء الإسفار التكملة ( BiFC). وشرك من التقنيات في المختبر هو أنها لا تعرف أين التفاعل يحدث التطور الطبيعي، في حين تشمل المذكورة آنفا في الجسم الحي تقنيات التعبير الاصطناعي من البروتينات الانصهار التي قد لا تعكس السلوك الأصلي من نظرائهم الذاتية. واحد الميزة الرئيسية لجيش التحرير الشعبى الصينى هو أنه قادر على تحديد داخل الأنسجة توطين التحت خلوية من interactors البروتين الذاتية التي هي على مقربة من بعضها البعض، ومن المرجح تشكيل المعقدة، مع درجة من التقارب المطلوب لتوليد إشارة يجري مقارنة لFRET وBiFC. PLA يمكن الكشف عن التفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية نظرا لاقتران الاعتراف الأجسام المضادة والتضخيم DNA. وهكذا، يمكن فحص توليد منفصلة، وإشارات مضيئة في شكل نقاط والتي تكشف عن الموضع الدقيق للتفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن المستضدات مرئية بالكاد. وأخيرا، جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية بسيطة نسبيا على القيام بها، ويستغرق مدة لا تزيد على إجراء المناعى القياسية لإكمال. ولذلك، يوفر PLA ميزة الفنية اكثر من غيرها من المقايسات التفاعل البروتين البروتين التي غالبا ما تعاني من الأوقات إعداد طويلة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعة النطاق.
يوضح هذا البروتوكول كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات في الموقع. هنا، يتم تنفيذ جيش التحرير الشعبى الصينى على اليرقات الاستعدادات العضلات جدار الجسم حيث يتم عرض DLG وHTS في الوجود الواقع في مجمع في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs. جيش التحرير الشعبى الصينى لم تستخدم سابقا لدراسة NMJ اليرقات، وهناك في الوقت الحاضر سوى عدد قليل من الأبحاث المنشورة التي استخدمت هذا الاختبار في الأنسجة ذبابة الفاكهة. ومن المؤمل أن مزيدا من التعرض لجيش التحرير الشعبى الصينى للمجتمع ذبابة الفاكهة سوف يؤدي إلى زيادة استخدامه كأداة إضافية لتكمل الأخرى، أكثر شيوعا البروتين البروتين المقايسات التفاعل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا التقرير كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ. يتم تنفيذ الفحص على اليرقات جدار الجسم الاستعدادات العضلات لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات الحاضرة في NMJ. مع هذه التقنية، وتظهر DLG وHTS ليكون على مقربة من بعضها البعض، وبالتالي وج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ذبابة الفاكهة مركز بلومينغتون المالية لتوفير مخزون الطاير. كما نشكر البنك دراسات الإنمائية هجين والدكتور لين كولي (جامعة ييل) لتوفير الأجسام المضادة. شكر خاص يذهب إلى AhHyun يو لمساعدتها على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (كريجر)، ويليام وادا إيزابيل صندوق الصلب (كريجر)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (هاردن).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. . Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. 遗传学. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
