共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現_A受容体

Sprague-DawleyラットまたはBAB / C近交系マウス（Harlan、英国、使用妊娠雌の数は30だった）が収容され、犠牲に英国内務省によると[と1986年11月24日（609分の86 / EEC）の欧州共同体理事会指令た]ガイドライン。プロジェクトが正式に薬局倫理委員会のUCL学校によって承認された。 楽器、培養培地、および皿の調製すべての回で、無​​菌条件下で動作させるためにオンにし、70％エタノールで層流フードを掃除。 ダルベッコ改変イーグル培地pHを7.4（DMEM、500ml）を、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン（50単位/ ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、ウシ胎児血清（10を含む、HEK293細胞培養培地を準備％）。 注：ペニシリンおよびストレプトマイシンは刺激物である。 Neurobasal培地のpHが7.4（500ml）を、B27サプリメント（25ml）中、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリンを含む、無血清ニューロン培地を準備（50単位/ ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、グルコース（6ミリモル）。 HBSS 10×ストック（50 ml）を含有する、HEPES緩衝化生理食塩水（HBSS）を500mlを調製し、HEPES（1 M）（5ml）および水（445ミリリットル）、pHが7.4。 オートクレーブを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4中、1 L）、水（1 L）、ガラスカバースリップ（直径13 mm）とし、それらを滅菌するガラスパスツールピペット。 α1/β3/γ2-GABA Aルピーを発現するHEK293安定細胞株の作製 10センチメートル無菌組織培養プレートにプレートに2×10 6 HEK293細胞を一晩70〜90％のコンフルエンシーに到達するために、加湿した5％の二酸化炭素（CO 2）雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃Сインキュベートする。 翌日、G418二硫酸塩（ 表1）耐性遺伝子を組み込んだPCDN 3.1（+）発現ベクターにGABA A Rα1サブユニットcDNAをHEK293細胞にトランスフェ負と錯体をカチオン性リポソーム製剤を用いた（両方ともヒトサイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーターの制御下）フレオマイシンD1（ 表1）耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクター中のGABA A Rのβ3サブユニットcDNAは、製造業者のプロトコルに従って荷電した核酸分子（ 表1）。 滅菌15mlの遠心管に構築リポソームトランスフェクションバッファリング試薬15μlの、続いて、ゆっくりと室温で離れる前に混ぜると各cDNAの7.5μgの、簡単に説明すると、減少した血清培地（ 表1 pH7.4）を500μlのを追加5分。 この混合物に、リポソームトランスフェクション試薬の8.75μlを添加し、穏やかに30分間室温で出る前に混合する。これに続いて、（抗生物質なし）をHEK293細胞培養培地3mlを追加し、二回上下transfeを遠心管の内容物をピペットrは滴下10cmの組織培養皿中で増殖する細胞への、及び加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃Сで48時間インキュベートする。 以下の比率で、滅菌PBS、pH7.4中で穏やかにHEK293細胞を洗浄し、新しい10cmの組織培養皿中にトランスフェクトされたHEK293細胞を希釈：1：3,1：5,1：7、1:10、1:15 1:20。これは、細胞が過度に密集​​していないことが保証されます。 培養培地に、各抗生物質選択マーカー、G418およびフレオマイシンD1の800μg/ mlのを追加することによって、GABA A Rサブユニットの両方を発現するHEK293細胞の選択を開始する。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベータ）内で37℃Сで細胞をインキュベートし、抗生物質含有培地（10ml）を2日ごとに交換してください。 小さな白いコロニーが（通常約7日後）を形成するために起動すると、慎重に皿のそれぞれから単一コロニーを選択し、滅菌P1000を使用してそれを集めるピペットチップ。上下培地をピペッティングすることによって再懸濁媒体注意深くを500μlを含む24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに移す。正確に一つのコロニー（5-20​​コロニーの合計が勧められる）を各ウェルに移されることを確認してください。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。 コロニーは70〜80％コンフルエントになったら、静かに24ウェル組織培養プレートの底から細胞を取り除くために、上下の媒体をピペット。転送し、6ウェル組織培養プレート中で2つのウェル間の細胞の懸濁液を分割する。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。 80％コンフルエント、同じ単一のコロンから生じる細胞を含む2つのウェルの1から細胞を収集する – 70回yおよび準備タンパク質溶解物。簡単に述べると、細胞をPBS、pH7.4で2倍洗浄し、そしてPBS、pH7.4中の2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）200μlを添加する。溶解液を収集し、マイクロ遠心チューブに移す。 BCAタンパク質試薬を用いてタンパク質濃度を測定し、製造業者のプロトコルに従って（ 表1参照）。これらの詳細については、表1を参照して、SDS / PAGEによるGABA A受容体の α1とβ3サブユニットの発現を分析し、（ウサギ抗α1固有およびウサギ抗β3固有のGABA A R抗体サブユニット特異的抗体を用いた免疫ブロッティング抗体）。 取り除くとより大きなを6cmの組織培養皿に残りのウェルからのみ陽性クローンを転送します。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。 徐々に細胞のuのコロニーを拡大する10cmの組織培養皿に、最終的に組織培養フラスコ（T-75フラスコ）に転送することにより抗生物質選択ファインダー。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。 プレートのガラスカバースリップ上の各コロニー〜70,000細胞（直径13 mm）の細胞表面発現および免疫蛍光法によってGABA A Rサブユニットの共局在を分析するために細胞を固定する。 （10センチメートル無菌の組織培養皿にGABA A受容体プレート2×10 6細胞の両方α1及びβ3サブユニットを高レベルで発現するHEK293細胞の陽性クローンを選択し、加湿した5％CO 2雰囲気中で37℃СインキュベートCO 2インキュベーター）中で一晩。細胞はすべての回で抗生物質含有（G418およびフレオマイシンD1）培地中でインキュベートすることを確認してください。 翌日、HEKをトランスフェクションGABA A Rとの293細胞をpcDNA™3.1（+）非リポソーム脂質トランスフェクション試薬（ 表1）を用いて、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクター中にサブユニットcDNAをγ2s。 注：このトランスフェクション法は、良好な生存および抗生物質を連続選択の下にあるの遅い成長、安定した細胞株における外来タンパク質の高い発現効率を可能にする。 無菌の15mlの遠心管中で、250エンハンサーμlのDNA凝縮バッファー（ 表1）及びγ2sGABAの1.4μgの受容体サブユニットcDNAを追加します。 5分間室温で離れる前に11.2エンハンサーμlの1秒間ボルテックスを追加します。 10分間室温で離れる前に10秒間非リポソームの脂質トランスフェクション試薬と渦の35μlを添加する。 G418 /フレオマイシンD1含有培地3mlを加え、二回BEF上下遠心管の内容をピペット鉱石は、10cmの組織培養プレート中で増殖する細胞上に滴下して転送する。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで48時間細胞をインキュベートします。 以下の比率で、無菌PBSで穏やかに細胞を洗浄し、新しい10cmの組織培養皿にそれらを希釈する：3、1：1：5,1：7 1:10 1:15および1:20。 G418 /フレオマイシンD1-含有培地に抗生物質選択マーカーハイグロマイシンBの800μgの/ mlに加えることによってγ2sユニットを発現α1/β3-HEK293細胞の選択を開始します。 2日ごとに新鮮なG418 /フレオマイシンD1 /ハイグロマイシンB含有培地（10ml）で古い培地を交換してください。 リピートは、G418 /フレオマイシンD1 /ハイグロマイシンB含有細胞培養培地中で連続選択の下で、2.7から2.12を繰り返します 。 抗生物質を含まない細胞培養培地と将来の使用のために、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）中で140℃にて陽性クローンを格納する。 レベルをテストα1の発現の、β3および式は、抗生物質選択下に起因する細胞の減少生存に変更することができますので、解凍後の各クローンにおける免疫ブロッティング及び免疫蛍光法により、GABA A Rサブユニットをγ2s。 HEK293細胞株のeメンテナンスコントロールのバイアルHEK293細胞または滅菌15ml中の細胞培養培地10ml中にα1/β2/γ2-GABA A値Rs（ 表1）または（上述の）α1/β3/γ2-GABA A Rs のいずれかを発現するもの霜遠心分離管。過剰DMSOを除去するために5分間440×gで遠心。 上清を除去し、新鮮な細胞培養培地1mlで細胞を再懸濁する。 最初のポリ-D-リジン（0.1 mg / ml）で再懸濁した細胞のその後1mlで被覆された10cmの組織培養皿に新鮮な細胞培養培地9mlを加える。細胞を分散し、加湿した中で37℃Сでインキュベートし、静かに左右にを攪拌5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）。 翌日、あらゆる細胞残屑を除去し、新鮮HEK293細胞培養培地10mlに交換する培地を吸引する。 GABA A Rサブユニットを発現し、したがって、抗生物質耐性マーカーの発現を欠いていない任意の細胞を除去するために抗生物質を含む安定な細胞株を選択する。 α1/β2/γ2安定細胞株の場合は、G418（800μgの/ ml）を含む新鮮な細胞培養培地で正常培地を交換してください。 α1/β3/γ2細胞株について、G418（800μgの/ ml）を含む新鮮な細胞培養培地と交換し、フレオマイシンD1（800μg/ ml）をとハイグロマイシンB（800μg/ ml）を。 注意！G418は刺激性であるとハイグロマイシンBは、腐食性の有毒刺激性である。 それらは> 70％のコンフルエンシーを達成一旦低い密度で播種して、新しい組織培養皿に継代細胞。吸引し、10の細胞培養培地1mlで2回洗浄簡潔PBS、pH7.4中。皿から細胞を剥離するために、PBS、pH7.4中のトリプシン-EDTA溶液、プロテアーゼトリプシン（0.05％トリプシン）の溶液およびCa 2+キレート剤EDTA（0.02％）の1ミリリットルを追加します。 注意！トリプシン-EDTA解決策は、刺激性である。 ディッシュに、適切な抗生物質を含む細胞培養培地10mlを加え、細胞を吸引する。 5分間440×gで細胞を遠心し、細胞培養培地5mlに再懸濁。 通路新鮮な細胞培養培地および適切な抗生物質を含む新しい組織培養フラスコ（T-75フラスコ）中に1:10希釈液を用いて細胞。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに培地を交換してください。継代細胞> 70％コンフルエントを（ ステップ2.8を参照）。 GABA作動性中型有棘ニューロン文化4.準備無菌条件下で24我々の準備ポリ-L-リシンとllのプレート（0.1 mg / mlで）をカバースリップ（直径13 mm）でコーティングさと加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃Сインキュベートする。 翌日、吸引ピペットで過剰ポリ-L-リジンとは、2つの短い10秒、滅菌水で2 5分の長い洗浄でカバーグラスを洗う。一晩ラミニン（0.01 mg / mlの）を追加し、加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сインキュベートする。 70％エタノールで解剖領域を消毒し、そのような湾曲した及び真っ直ぐ組織鉗子、はさみ、ピンセットなどのツールを切開するの配列を収集し、完全に解剖器具を滅菌するために70％エタノールに入れる。 その背中にCO 2で安楽死させ、妊娠ラット/マウスを置き、70％エタノールで腹部の皮膚をきれいに。内臓や子宮を明らかにするために、ピンセットで皮膚をつまんで、皮膚、筋肉、および腹膜を通して腹部にカット明らかに胚を持つ。子宮から胚（E16-17）を抽出し、チルドPBSでペトリ皿に置いてください。 層流フード中で胚を置き、冷却HBSSを含む新しいペトリ皿に頭を集め、それらの首を切る。 解剖顕微鏡下で、湾曲したストレート鉗子を用いて脳を解剖する。チルドHBSSを含む新しいペトリ皿に脳を置きます。 2大脳半球を分離し、慎重に髄膜を除去します。海馬のラインに沿ってカットし、線条体を明らかにする皮質バックはがします。半球の前で横紋白い構造として線条体を守ってください。 線条体を解剖し、非常に小さな断片にカット（1 – 直径2mm）し、1mlの総容積で、無菌の15ml遠心チューブに材料を収集するために熱加工パスツールピペットを使用。火研磨材が損傷を受けることなく収集されることを確実にする。 火災研磨TIを使用してパスツールピペットのpは、細胞を吸引し、それらに8リリース – 10回。それが均質に表示されるまで、6回 – その元の直径（1ミリメートル）の約30％の火ポリッシュチップで新しいピペットを取って、ソリューションをさらに4を粉砕する。 新しい滅菌遠心管に100μmのナイロン細胞ストレーナーを用いて細胞をフィルタ。 血球計で細胞を計数し、24ウェル組織培養プレートにウェルあたりのニューロン培養培地500μlに7万細胞をプレー。ウェルは左から右へ、そしてインビトロ （DIV） で 14日間加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сインキュベート攪拌する。 ウェルにそれらの増殖を停止するために、7日後に、グリア細胞が存在する場合、（5μMのAra-C）、シトシンβ-D-アラビノシドを追加し、神経細胞培養物の純度を確認し。これを行うために、各ウェルから神経細胞培養液（pH7.4）を250μlのを除去し、新鮮な培地250μlのが含まれている追加INGのAra-C。 注意！アラ-Cは刺激性である。 5.共培養の準備神経培養の11日目に、無菌条件下で、ポリ-D-リジン（0.1 mg / mlで）を用いてコート6ウェルプレートし、加湿5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃で一晩インキュベートС。 翌日（神経培養の12日目）、過剰なポリ-D-リジンを吸引し、少量で被覆する（抗生物質なし）をウェルに新鮮な細胞培養培地を添加する前に滅菌水で5分間、ウェルを2回簡単かつ2回洗浄培地からの血清の。 組織培養フラスコ（T-75）からの培養培地を吸引除去する。 Ca 2+の1ミリリットルを加える前に二回PBSで細胞をすすぎ/ Mg 2+をキレート化剤はEDTAで穏やかに非酵素的に細胞を解離する（0.48 mm）である。組織フラスコの底からそれらを切り離すために細胞を攪拌。 （細胞培養培地10mlを追加）これは、トランスフェクションを妨害し得るような、抗生物質を含まない滅菌遠心管に細胞及び場所を吸引する。低速ベンチトップ遠心機を用いて5分間、440×gで細胞をペレット。 上清を除去し、新鮮な細胞培養培地1mlで細胞を再懸濁する。血球計数器を用いて、6ウェルプレート中ウェルあたり3×10 5細胞の密度で細胞をプレートカウント。優しく攪拌し、加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で、37℃Сで24時間インキュベートする。 翌日（神経培養の13日目）は、一過性リポソームトランスフェクション試薬を使用して、pcDNA3発現構築物中にmCherryをcDNAをHEK293細胞にトランスフェクト。簡単に言うと、滅菌マイクロチューブに、減少した血清培地500μlとmCherryをcDNAの5μgのを追加します。リポソームバッファリング試薬を5μl加え、穏やかに5分間室温で離れる前に混ぜる。 リポソームのトランスフェクションREAGの8.75μlを添加する優しくENTと30分間室温で離れる前に混ぜる。 （CO 2インキュベーター）転送滴下6ウェル組織培養プレートの各へと加湿5％CO 2雰囲気中で37℃でインキュベートС、二回上下に微小遠心管の内容物をピペット。 翌日（神経培養の14日目）、6ウェルのそれぞれからのHEK293細胞培養培地を吸引し、PBS（pH7.4）で各ウェルを二回簡単に洗浄する。 Ca 2+の300μlを添加/ Mg 2+をキレート化剤はEDTA（0.48ミリモル）およびトリプシン-EDTA200μlの（0.02から0.48 mM）の各ウェルに解決し、5分間37℃Сインキュベートする。 ウェルあたり新鮮HEK293細胞培養培地1mlを加える（これはトリプシンを消光）し、無菌の15ml遠心分離管に分離した細胞を吸引する。室温で5分間、440×gで細胞を遠心し、上清を除去。神経細胞培養液（pH7.4）を500μlにペレットを再懸濁します。</ LI> 血球計数器を用いて、神経細胞を含む24ウェル組織培養プレート中にウェル当たり30,000細胞の密度で細胞および種子を数える。細胞を分散し、24時間加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベータ ）内で37℃Сで共培養をインキュベートするためのプレートを攪拌。 6.シナプスの連絡先の分析とその活動共培養中で23時間後、蛍光色素と結合した抗シナプトタグミン腔側ドメイン特異的抗体の活性依存取り込みを使用してGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞間の「アクティブ」コンタクトの形成を調査（Cy5では、 表1を参照） 。 NOTE：抗体は、シナプス小胞の内腔と細胞外空間との間に連続性がある場合にそれが結合するシナプトタグミンの管腔ドメインへのアクセスを得ることができる。これは、特にこのantibを作り、神経伝達物質の放出の間に起こるアクティブなシナプス前終末の優れたマーカーをODY。 （神経基本培地、pH7.4の; 表1を参照）まず、ニューロン培地で共培養物を洗浄し、Cy5標識マウス抗シナプトタグミン抗体を追加し、（神経基本培地、pH7.4）中のニューロン培地で1:50に希釈培養物を、30分間。加湿した5％CO 2雰囲気下で37℃Сでこの時間（CO 2インキュベーター）の間に細胞をインキュベートします。 、抗体のアクセスを削除する共培養簡潔に3回洗浄する：第200 mMのNaClを含有する冷PBS（pH7.4）で、冷たい通常のPBS（pH7.4）で最初に、冷通常のPBS（pH7.4）で第三撹拌しながら10分間PBS中の4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース（PFA、pH7.4）を300μlの細胞を固定。 2長い10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄する。 PFAをクエンチする攪拌しながら10分間各ウェルにグリシン（0.3 M）を追加します。 細胞を洗浄brieflyは二回PBS（pH7.4）で、その後（PBS、pH7.4中の1％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA））ブロッキング溶液を300μlを添加する前に二つの長10分間の洗浄との非特異的結合を減少させる抗体。 4°Сで一晩：吸引しブロッキング溶液およびγ2N末端 ​​ドメイン33（PBS、pH7.4中3000 1）に対して向けられたモルモット抗GABA A R-γ2抗体を追加します。 翌日、ウェルから一次抗体を吸引し、2より長い10分間の洗浄、次いでPBSで簡単に二回細胞を洗浄。 室温で30分間ブロッキング溶液中のTriton X-100（0.1％）を用いて細胞を透過。 マウス抗グルタミン酸脱炭酸酵素のいずれかを追加する前に2つの長い10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄する（GAD）65抗体（1：4000、 表1）またはマウス抗シナプシンI抗体（ 1：1,000、 表1）を室温tで120分間emperature。 二つの長10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄し、次いで室温で30分間ブロッキング溶液を加える。 遠心適切な二次抗体での抗体の凝集物を除去するために（Cy5をコンジュゲートし、典型的にはヤギ抗モルモットIgGを、ヤギ抗マウスIgGを、アレクサフルオロ488、またはすべてを2μg/ mlのヤギ抗マウスIgGアレクサフルオロ405にコンジュゲート） 21910 10分間XG、および抗体（1：750）を追加するブロッキング溶液に。 1時間、ウェルを適切な光暴露およびその結果として光退色からの蛍光団を保護するためにアルミホイルでカバーするように適用される。 最後に、すべての非結合二次抗体を除去し、マウント試薬（延ばすゴールド、 表1）カバースリップあたりおよそ10μlのを使用してカバースリップをマウントするために2より長い10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄します。 4に転送する前に、光から保護しながら室温に設定する24時間を許可する長期保存のためС°。 63X油浸対物レンズとレーザ走査型共焦点顕微鏡を用いてサンプルを分析する。光のレベルを確保し、検出器利得は飽和を回避するように調整される。 IまたはCy5標識抗シナプトタグミンシナプシンGAD65のための肯定的なシナプス前終末、およびDICによ​​って、またはmCherryを蛍光インジケータによって可視化シナプス後のHEK293細胞間の共局在の領域のような潜在的なシナプスのような接点を守ってください。 イメージングソフトウェアを使用して、細胞当たり5〜 – 4の深さを通して – （10 8）光学切片のZスタックシリーズを使用して、潜在的なシナプスのような接点を数える。