Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu
Summary
Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.
Abstract
Burada kerevit karın sinir kordonu diseksiyonu göstermektedir. Hazırlık son iki göğüs gangliyonları (T4, T5) ve karın ganglionlar zincirini (A6 A1) içermektedir. Yüzgeç sistemi: ganglion Bu zincir pleopods (swimmerets) koordineli lokomosyon sürücüler santral sinir sistemi (MSS) kısmını kapsamaktadır. Bu kerevit her yüzgeç ritmik alternatif aktivite 1-3 üretir kendi bağımsız desen üreten çekirdek tarafından tahrik beş yılı aşkın bir süredir bilinmektedir. motor nöronlar, her yüzgeç ve kas anatomik ve fonksiyonel olarak farklı popülasyonlar 4 iki içermektedir innerve. Bir yüzgeç geri çekilmesi (güç inme, PS) sorumludur. Diğer yüzgeç protraksiyonuna (dönüş inme, RS) sürücüler. Yüzgeç sisteminin motor nöronlar kendiliğinden in vivo olarak kaydedilen model ile aynı olan bir hayali motor modelini üretmek mümkün </em> 1.
Bu raporun amacı, ritim üreten ağları ve öğrencilerin pratik laboratuar dersleri için bağımsız microcircuits koordinasyonu çalışmak için ilginç ve kullanışlı bir model sistemini tanıtmaktır. sağlanan protokol, ganglionlar izole zincirinin çivileme ganglionlar desheathing ve izole sinir sisteminden ekstraselüler swimmerets kurgusal motorlu desen kayıt, kerevit karın sinir kordonu diseksiyon için adım adım yönergeler içerir.
Ayrıca, biz dendritler hücre kaydedilen yüzgeç nöronların aktivitesini izleyebilirsiniz. İşte biz de kısaca bu teknikleri tanımlamak ve bazı örnekler sunmak. Ayrıca, yüzgeç nöronların morfolojisi çeşitli boyama teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir. Burada boya dolu nöronlar ve yüzgeç motor nöron havuzları Dolgularda (iyontoforez ile) hücre içi örnekler sunmak. Bizim laboratuvardaBiz hücresel düzeyde microcircuits arasındaki kurgusal lokomosyon, MSS aktivitesine duyusal geribildirim etkisi ve koordinasyon temel fonksiyonlarını incelemek için bu hazırlık kullanın.
Introduction
kerevit swimmerets duruş kontrolünde bir işlevi yerine ve hayvanlar ileri yüzmek ritmik zaman yendi, kendi Burrows veya kadın kendi yumurta 5, 6 havalandırır havalandırın. Sinyal kerevit, Pacifastacus leniusculus ve swimmerets, beşte ikinci gelen çiftler meydana Karın 7 her tarafında bir uzuv ile karın segment. merkezi sinir sistemi hayvanda yanı sıra izole edilmiş sinir kablosu hazırlanmasında yüzgeç hareketini tahrik kendi ritmik motorlu kalıbında üretir. Duyu geri bildirim veya azalan girişi mevcut olduğunda üretilen ritmik motorlu model kurgusal lokomosyon 1, 2 denir. Yüzgeç sisteminde bu motorun model sağlam hayvan ölçülen swimmerets aktivitesi herhangi parametrede farklı değildir.
Her bir yüzgeç hareketi bulunan ve bir c sınırlı bir mikro devre ile tahrik edilirhemiganglion 1 orresponding -. 3 Her mikrodevre beş tanımlanan olmayan çivileme internöronlardan içeren bir desen üreten çekirdek vardır. Onlar işlevsel olarak karakterize edilebilir ya Güç İnme önleyici (IPS) ya da Return İnme önleyici (IRS) 8. Kendi alternatif aktivite karşılıklı inhibisyonu 9 ile tahrik edilir ziyade bu IPS ve IRS internöron, endojen osilatörler değildir. Bu internöron doğrudan yüzgeç motor nöronları inhibe Çünkü, alternatif PS-RS hareketi 10 oluşturulur. Hareket ancak, sadece, aynı zamanda farklı bağımsız microcircuits koordinasyon aktivitesi üretilmesini gerektirir, ancak değildir. Yüzgeç sisteminde bu koordinasyon uzuvlar doğru zamanlarda aktif olmasını sağlar koordine mikro devre ile kurulur. Bu mikrodevreli, her segmentteki 11-15 belirlenmiş üç nöronlar tarafından inşa edilmiştir.
Bu protokol, th sağlare ilk kez bir adım-adım diseksiyonu kılavuz ganglionlar (A6 T4, Şekil 1) zincirini izole etmek. Biz izole karın sinir kablosunu pin ve her ganglion desheathe nasıl gösterir. Bu izole edilmiş sinir sistemi hazırlanırken, yüzgeç hareketten sorumlu nöronlar elektrofizyolojik ve morfolojik deneylerinde kullanılmak üzere hazırdır. Bu protokolün ikinci bölümü yüzgeç motorlu modelinin temel özelliklerini gösterir. Bu hücre dışı kayıt için bir adım-adım kılavuzunu yüzgeç motor nöronların aktivitesini içerir. RS motor nöronların aksonları PS motor nöronların aksonları aynı sinirin posterior dalı ile (Şekil 1) proje ise, sinir N1 ön dalı ile proje 4. Bu nedenle onların faaliyet diferansiyel pim elektrotlar ile bu şubelerden kaydedilebilir.
<br/> Şekil 1: karın ganglion 6 (A6) ve T4 şematik diyagram göğüs ganglion 4 (T4) İzole sinir sistemi:. Torasik ganglion 4; T5: Torasik ganglion 5; A1, A2 … A6 karın ganglion 1, karın ganglion 2 … karın ganglion 6; N1: sinir N1; N2: sinir N2; N3: sinir N3; PS: Güç-inme; RS: dönüş inme. Yön kısaltmalar: A = ön; P = arka.
Bu diseksiyon prosedürü ve gösterdi elektrofizyolojik tekniği lisans öğrencileri için uygundur ve fizyoloji öğrenci uygulamalı dersler tamamlayabilir. gangliyonların izole zincir sinir sistemi işlevini, koordinasyon veya yüzgeç microcircuits 6 modülasyonunu olarak hareket yeteneği 16, 17 adaptif davranış nöronal kontrol çalışması için deneyler bir dizi kullanılmıştır. kerevit yüzgeç sistemi böylece çok büyük bir miktarını temin ilginç öğretim veya tTüm kerevit ve kurgusal motorlu modelinin dışı kayıt ventral sinir kordonu diseksiyonu ile başlayan fırsatlar yağıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kerevit anatomisi ve karın ganglionlar önce 5, 18, 19, 20 tarif edilmiştir ve önemli sinirlerin kesilmesi önlemek için diseksiyon önce onlarla aşina olmak için tavsiye edilir.
Bu izole sinir kablosu bozulmasını önlemek için 23 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda hazırlık tutmak için kritik öneme sahiptir. Bu yıkama çözeltisine, soğuk kerevit tuzlu su ile 20-30 dk değiştirilmesiyle kolayca elde edilebilir. Bu koşullar altında, gangliyonları…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bazı rakamlar ile yardımcı olmak için Jos Burgert teşekkür ederiz. Biz Ingo Selbach (ve grubu "Edelkrebsprojekt NRW") deney hayvanları ile laboratuvar tedarik çabalarıyla minnettarız. Biz yazının ilk sürümlerini kontrol Anna C. Schneider teşekkür ederim. Bu araştırma Emmy Noether DFG hibe SM 206 / 3-1 ve kadın öğretim üyeleri için Köln Üniversitesi başlangıç hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Type | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | for extracellular recording | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | for intracellular recording | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A | digitizes recorded signals |
| big bucket | filled with ice | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard | for extracellular recording |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 | |
| computer and monitor | equipped with recording software | for extracellular recording | ||
| container and pipette for liquid waste | ||||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | always keep at temperatures ~ 4° C | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 | for intracellular dyefill of neurons |
| differential pin electrodes | made from stainless steel ɸ 0.2 mm | for extracellular recording | ||
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | used in the gross disection | ||
| faraday cage | for extracellular recording | |||
| fixing pins | for pinning the specimen | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 | fine forceps: used to pick nerves |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 | extra fine forceps: used for desheathing |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 | coarse forceps: used to grab specimen and pins |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 | for intracellular recording and dyefill of neurons |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x – 8x | Leica, Germany | 10446298 | for extracellular recording |
| microscope table | for extracellular recording | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | for extracellular recording | ||
| modeling clay | for extracellular recording | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x – 4.5x | Olympus, Germany | for the dissection | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 | used to pin the isolated chain of ganglia |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 | for gross dissection (steps 2.1 – 2.11) |
| saline dispenser with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. | Volume ~ 60ml, | used for exsanguination | ||
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 | for desheathing |
| stainless steel wire ɸ 0.125 mm | to cut pins of 4-7 mm length | Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany | for pinning of the nerve cord | |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 | for gross and fine disection (steps 2.11 – 3.14) |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | ||
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip | for extracellular recording |
References
- Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
- Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
- Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
- Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
- Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
- Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
- Huxley, T. H. . The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).
- Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
- Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
- Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
- Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
- Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
- Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
- Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
- Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
- Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
- Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
- Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
- Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
- Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
- Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
- Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts – Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
- Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).
