Summary

El Sistema Swimmeret de cangrejo de río: Una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares Grabaciones del patrón motor

Published: November 25, 2014
doi:

Summary

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Abstract

Aquí se demuestra la disección del nervio espinal cangrejos abdominal. La preparación comprende los dos últimos ganglios torácicos (T4, T5) y la cadena de ganglios abdominal (A1 a A6). Esta cadena de ganglios incluye la parte del sistema nervioso central (CNS) que impulsa la locomoción coordinada de los pleópodos (swimmerets): el sistema swimmeret. Se sabe desde hace más de cinco décadas que en los cangrejos cada swimmeret es impulsada por su propio núcleo generadores de patrones independiente que genera la actividad rítmica alternancia 1-3. Las neuronas motoras que inervan la musculatura de cada swimmeret comprender dos anatómica y funcionalmente distintas poblaciones 4. Uno de ellos es responsable de la retracción (carrera de potencia, PS) de la swimmeret. El otro impulsa la prolongación (carrera de retorno, RS) de la swimmeret. Las neuronas motoras del sistema swimmeret son capaces de producir espontáneamente un patrón motor ficticio, que es idéntico al patrón grabado en vivo </em> 1.

El objetivo de este informe es dar a conocer una interesante y conveniente sistema modelo para el estudio de las redes y la coordinación de los microcircuitos independientes para prácticas de laboratorio de los estudiantes de generación de ritmo. El protocolo previsto incluye paso a paso las instrucciones para la disección del cordón nervioso abdominal del cangrejo de río, el fijar de la cadena de aislados de ganglios, desheathing los ganglios y registrando el patrón motor ficticio swimmerets extracelular del sistema nervioso aislado.

Además, podemos controlar la actividad de las neuronas swimmeret registrados intracelularmente a partir de las dendritas. Aquí también se describe brevemente estas técnicas y proporcionamos algunos ejemplos. Además, la morfología de las neuronas swimmeret se puede evaluar usando varias técnicas de tinción. Aquí proporcionamos ejemplos de intracelular (por iontoforesis) tinte lleno neuronas y rellenos de grupos de neuronas motoras swimmeret. En nuestro laboratorioutilizamos esta preparación para estudiar las funciones básicas de locomoción ficticia, el efecto de la retroalimentación sensorial sobre la actividad del SNC, y la coordinación entre los microcircuitos en un nivel celular.

Introduction

Los swimmerets de cangrejos de río tienen una función en el control de la postura y la golpeaban rítmicamente cuando los animales nadan hacia adelante, ventilar sus madrigueras o hembras airean sus huevos 5, 6. Los swimmerets del cangrejo señal, Pacifastacus leniusculus, ocurren en pares de la segunda a la quinta segmento abdominal, con una extremidad a cada lado del abdomen 7. El sistema nervioso central produce en su propia el golpeteo rítmico motor que impulsa el movimiento swimmeret en el animal intacto, así como en la preparación cordón nervioso aislado. Cuando no hay retroalimentación sensorial o de entrada presente descendente el patrón motor rítmico producido se llama la locomoción ficticia 1, 2. En el sistema swimmeret este patrón motor no difiere en cualquier parámetro de la actividad de los swimmerets medidos en el animal intacto.

El movimiento de cada swimmeret es accionado por un microcircuito que se encuentra en y limitado a un corresponding hemiganglion 1 -. 3 En cada microcircuito hay un kernel generadores de patrones que se compone de cinco interneuronas no enriquecidas identificados. Pueden caracterizarse funcionalmente como siendo Inhibidor de Power Stroke (IPS) o inhibidor de la carrera de retorno (IRS) 8. Estos IPS y interneuronas IRS no son osciladores endógenos, en lugar de su actividad alterna es impulsado por la inhibición recíproca 9. Debido a que estas interneuronas inhiben directamente las neuronas motoras swimmeret, la alternancia PS-RS movimiento se genera 10. Locomotion sin embargo, no sólo requiere la generación de actividad, sino también la coordinación de los diferentes microcircuitos independientes. En el sistema swimmeret dicha coordinación es establecida por el microcircuito de coordinación que asegura que las extremidades son activos en tiempos correctos. Este microcircuito es construido por tres neuronas identificadas en cada segmento de 11 a 15.

Este protocolo prevé ªe primera vez una guía disección paso a paso para aislar la cadena de ganglios (T4 a A6, Figura 1). Mostramos cómo la clavija del cable aislado nervio abdominal y desheathe cada ganglio. En este aislado de preparación del sistema nervioso, las neuronas responsables del movimiento swimmeret están listos para su uso en experimentos electrofisiológicos y morfológicos. La segunda parte de este protocolo demuestra las principales características del patrón motor swimmeret. Esto incluye una guía paso a paso para grabar extracelularmente la actividad de las neuronas motoras swimmeret. Los axones de las neuronas motoras RS proyectan a través de la rama anterior del nervio N1, mientras que los axones de las neuronas motoras PS proyectan a través de la rama posterior del mismo nervio (Figura 1) 4. Por lo tanto su actividad se puede grabar a partir de estas ramas con electrodos diferenciales pines.

Figura 1<br/> Figura 1: Aislado sistema nervioso de ganglio torácico 4 (T4) para ganglio abdominal 6 (A6) y un diagrama esquemático de que T4:. Ganglio torácico 4; T5: ganglio torácico 5; A1, A2 … A6 ganglio abdominal 1, el ganglio abdominal 2 … ganglio abdominal 6; N1: nervios N1; N2: nervio N2; N3: nervio N3; PS: el poder de carrera; RS: vuelta de carrera. Abreviaturas direccionales: A = anterior; P = posterior.

Este procedimiento de disección y la técnica electrofisiológica demostrado son convenientes para los estudiantes de pregrado y pueden complementar los cursos prácticos de los estudiantes en la fisiología. La cadena aislado de los ganglios se ha utilizado en una serie de experimentos para estudiar la función del sistema nervioso, la coordinación, o modulación de microcircuitos swimmeret 6 así como el control neuronal de la conducta adaptativa en la locomoción 16, 17. Así, el sistema swimmeret cangrejo de río proporciona una cantidad enorme de la enseñanza interesante o tllover las oportunidades que todos comienzan con la disección del cordón nervioso ventral de cangrejos de río y registro extracelular del patrón motor ficticio.

Protocol

Este procedimiento de disección está de acuerdo con las Comunidades Europeas Directiva del Consejo de 22 de septiembre de 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparación Obtener cangrejos, Pacifastacus leniusculus (Dana), de ambos sexos ≥8 cm de tamaño. Asegúrese de que los animales son vitales y las extremidades y abdomen abdominales están intactos. Tenga cuidado para inspeccionar el caparazón y que esta cutícula es duro y rígido. Antes y animales pos…

Representative Results

Con las grabaciones extracelulares simultáneas de RS y PS, las neuronas motoras de un ganglio, la actividad alterna de estos conjuntos de neuronas motoras, se puede controlar (Figura 18), lo que representa el patrón de locomoción ficticia. Figura 18: Esquema de un ganglio y la colocación del electrodo de patilla diferencial registro extracelular de RS neuronas motoras (trazo…

Discussion

La anatomía del cangrejo de río y su ganglio abdominal se ha descrito anteriormente 5, 18, ​​19, 20 y se recomienda para familiarizarse con ellos antes de la disección para evitar el corte de nervios importantes.

Es fundamental para mantener la preparación a temperaturas inferiores a 23 ° C para evitar la degradación del cordón nervioso aislado. Esto se puede conseguir fácilmente mediante la sustitución de la solución de baño cada 20-30 min con solución salin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Jos Burgert por ayudar con algunas de las figuras. Estamos muy agradecidos a Ingo Selbach (y el grupo "Edelkrebsprojekt NRW") por sus esfuerzos para suministrar el laboratorio con animales de experimentación. Damos las gracias a Anna C. Schneider para la corrección primeras versiones del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por una beca SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 y una subvención de inicio de la Universidad de Colonia para la facultad femenina.

Materials

Name of Material/ Equipment Type Company Catalog Number Comments/   Description
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany for extracellular recording
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA
63-534 for intracellular recording
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A digitizes recorded signals 
big bucket  filled with ice
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard for extracellular recording
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software for extracellular recording
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.  always keep at temperatures ~ 4° C
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328 for intracellular dyefill of neurons
differential pin electrodes made from stainless steel ɸ 0.2 mm for extracellular recording
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone used in the gross disection
faraday cage for extracellular recording
fixing pins for pinning the specimen
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20 fine forceps: used to pick nerves
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20 extra fine forceps: used for desheathing
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20 coarse forceps:                          used to grab specimen and pins
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10 for intracellular recording and dyefill of neurons
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x – 8x Leica, Germany 10446298 for extracellular recording
microscope table for extracellular recording
mirror to illuminate preparation from below for extracellular recording
modeling clay for extracellular recording
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x – 4.5x Olympus, Germany for the dissection
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180 used to pin the isolated chain of ganglia
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13 for gross dissection                    (steps 2.1 – 2.11)
saline dispenser  with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. Volume ~ 60ml, used for exsanguination
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08 for desheathing 
stainless steel wire ɸ 0.125 mm  to cut pins of 4-7 mm length Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany for pinning of the nerve cord
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00 for gross and fine disection        (steps 2.11 – 3.14)
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip for extracellular recording

References

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check_url/cn/52109?article_type=t

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Cite This Article
Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

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