Summary

O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor

Published: November 25, 2014
doi:

Summary

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Abstract

Aqui demonstramos a dissecção do cordão nervoso abdominal lagostim. A preparação compreende os dois últimos gânglio torácico (T4, T5) e a cadeia de gânglios abdominal (A1 a A6). Esta cadeia de gânglios inclui a parte do sistema nervoso central (SNC) que leva a locomoção coordenada dos pleópodos (pleópodes): o sistema swimmeret. Ele é conhecido por mais de cinco décadas em que lagostas cada swimmeret é impulsionado por seu próprio padrão do kernel gerando independente que gera atividade rítmica alternando 1-3. Os neurônios motores que inervam a musculatura de cada swimmeret compreendem dois anatômica e funcionalmente distintas populações 4. Uma delas é responsável pela retração (curso de potência, PS) do swimmeret. O outro impulsiona o protraction (curso de retorno, RS) da swimmeret. Os neurónios motores do sistema swimmeret são capazes de produzir espontaneamente um padrão fictício do motor, que é idêntico ao padrão gravado in vivo </em> 1.

O objetivo deste relatório é a introdução de um sistema modelo interessante e conveniente para o estudo de redes de geração de ritmo e coordenação dos microcircuitos independentes para cursos práticos de laboratório dos alunos. O protocolo fornecido inclui instruções passo-a-passo para a dissecação de cordão nervoso abdominal do lagostim, prendendo da cadeia isolado de gânglios, desheathing gânglios e registrando o swimmerets padrão motor fictício extracelular do sistema nervoso isolado.

Além disso, podemos monitorar a atividade dos neurônios swimmeret gravadas intracelular de dendritos. Aqui também descrever brevemente essas técnicas e dar alguns exemplos. Além disso, a morfologia de neurónios swimmeret pode ser avaliada utilizando várias técnicas de coloração. Aqui nós fornecemos exemplos de intracelular (por iontoforese) Dye preenchido neurônios e aterros de pools de neurônios motores swimmeret. No nosso laboratóriousamos esta preparação para estudar as funções básicas de locomoção fictício, o efeito de retorno sensorial sobre a actividade do sistema nervoso central, e a coordenação entre microcircuitos a um nível celular.

Introduction

Os swimmerets de lagostins servem a uma função no controle da postura e bater ritmicamente quando os animais nadar para a frente, ventilar suas tocas ou fêmeas arejar seus ovos 5, 6. Os swimmerets do lagostim sinal, Pacifastacus leniusculus, ocorrem em pares do segundo para o quinto segmento abdominal, com um membro de cada lado do abdômen 7. O sistema nervoso central produz por si própria o alinhador rítmica do motor que acciona o movimento swimmeret no animal intacto, bem como na preparação de nervo isolado cabo. Quando não há feedback sensorial ou descendente de entrada presente o padrão motor rítmica é chamado locomoção fictício 1, 2. No sistema swimmeret este padrão motor não diferem em qualquer parâmetro da actividade dos pleópodes medidos no animal intacto.

O movimento de cada swimmeret é accionado por um microcircuito que está localizado dentro e restrita a um corresponding hemiganglion 1 – 3. Em cada microcircuito há um núcleo de geração de padrões que compreende cinco identificados interneurons não spiking. Eles podem ser funcionalmente caracterizada como sendo ou Inibidor de Power Stroke (IPS) ou inibidor de Retorno Curso (IRS) 8. Estes IPS e interneurônios IRS não são osciladores endógenos, em vez da sua actividade alternada é impulsionado por inibição recíproca 9. Porque estes interneurônios inibem os neurônios motores swimmeret diretamente, o movimento alternado PS-RS é gerado 10. Locomoção no entanto, não requerem apenas a geração de actividade, mas também a coordenação das diferentes microcircuitos independentes. No sistema swimmeret essa coordenação é estabelecida pelo microcircuito coordenação que assegura que os membros estão ativos em horários corretos. Este microcircuito é construído por três neurônios identificados em cada segmento 11-15.

Este protocolo prevê the primeira vez um passo-a-passo para isolar a dissecção de gânglios da cadeia (T4 para A6, Figura 1). Mostramos como fixar o cordão nervoso abdominal isolada e desheathe cada gânglio. Neste isolado de preparação do sistema nervoso, os neurônios responsáveis ​​pelo movimento swimmeret estão prontos para uso em experimentos eletrofisiológicos e morfológicos. A segunda parte deste protocolo demonstra as principais características do padrão motor swimmeret. Isto inclui um guia passo-a-passo para registro extracelular a atividade dos neurônios motores swimmeret. Os axônios dos neurônios motores RS projetar através do ramo anterior do nervo N1, enquanto axônios dos neurônios motores PS projeto por meio do ramo posterior do mesmo nervo (Figura 1) 4. Por isso a sua atividade pode ser gravado a partir destes ramos com eletrodos diferenciais pinos.

Figura 1<br/> Figura 1: Isolado sistema nervoso de gânglio torácico 4 (T4) ao gânglio abdominal 6 (A6) e um diagrama esquemático de que T4:. Gânglio torácico 4; T5: gânglio torácico 5; A1, A2 … A6 gânglio abdominal 1, gânglio abdominal 2 … gânglio abdominal 6; N1: nervo N1; N2: nervo N2; N3: nervo N3; PS: power-acidente vascular cerebral; RS: return-acidente vascular cerebral. Abreviaturas direcionais: A = anterior; P = posterior.

Este procedimento de dissecção e a técnica eletrofisiológica demonstrado são convenientes para estudantes de graduação e podem complementar de estudantes de cursos práticos em fisiologia. A cadeia isolada de gânglios foi usado em uma série de experiências para estudar a função do sistema nervoso, a coordenação, ou modulação de microcircuitos swimmeret 6, bem como o controlo neuronal do comportamento adaptativo na locomoção 16, 17. O sistema de lagostas swimmeret proporciona assim uma enorme quantidade de ensino interessante ou tchovendo oportunidades que todos começam com a dissecção do cordão nervoso ventral de lagostins e gravação extracelular do padrão motor fictício.

Protocol

Este procedimento de dissecção está em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias do dia 22 de Setembro 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparação Obter lagostas, Pacifastacus leniusculus (Dana), de ambos os sexos ≥8 cm de tamanho. Certifique-se de que os animais são vitais e abdome e dos membros abdominais estão intactos. Tome cuidado para inspecionar a carapaça e que esta cutícula é dura e rígida. Pré- e pós-muda anima…

Representative Results

Com as gravações extracelulares simultâneas de RS e PS, os neurônios motores de um gânglio, a atividade alternada dessas piscinas do neurônio motor, podem ser monitorados (Figura 18), o que representa o padrão de locomoção fictício. Figura 18: Esquema de um gânglio e colocação de eletrodos diferencial pin gravação Extracelular de RS neurônios motores (traço supe…

Discussion

A anatomia de lagostins e seus gânglios abdominal tem sido descrito anteriormente 5, 18, ​​19, 20 e recomenda-se a familiarizar-se com eles antes da dissecção, a fim de evitar o corte de nervos importantes.

É crítico para manter a preparação, a temperaturas inferiores a 23 ° C para evitar degradação do cabo de nervo isolado. Isto pode ser facilmente conseguido por substituição da solução de banho a cada 20-30 min com solução salina fria lagostas. Nestas c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Jos Burgert para ajudar com algumas das figuras. Somos gratos a Ingo Selbach (e do grupo "Edelkrebsprojekt NRW") por seus esforços para fornecer o laboratório com animais experimentais. Agradecemos a Anna C. Schneider para reler primeiras versões do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa de SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 e uma subvenção de arranque da Universidade de Colônia para professores do sexo feminino.

Materials

Name of Material/ Equipment Type Company Catalog Number Comments/   Description
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany for extracellular recording
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA
63-534 for intracellular recording
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A digitizes recorded signals 
big bucket  filled with ice
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard for extracellular recording
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software for extracellular recording
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.  always keep at temperatures ~ 4° C
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328 for intracellular dyefill of neurons
differential pin electrodes made from stainless steel ɸ 0.2 mm for extracellular recording
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone used in the gross disection
faraday cage for extracellular recording
fixing pins for pinning the specimen
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20 fine forceps: used to pick nerves
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20 extra fine forceps: used for desheathing
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20 coarse forceps:                          used to grab specimen and pins
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10 for intracellular recording and dyefill of neurons
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x – 8x Leica, Germany 10446298 for extracellular recording
microscope table for extracellular recording
mirror to illuminate preparation from below for extracellular recording
modeling clay for extracellular recording
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x – 4.5x Olympus, Germany for the dissection
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180 used to pin the isolated chain of ganglia
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13 for gross dissection                    (steps 2.1 – 2.11)
saline dispenser  with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. Volume ~ 60ml, used for exsanguination
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08 for desheathing 
stainless steel wire ɸ 0.125 mm  to cut pins of 4-7 mm length Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany for pinning of the nerve cord
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00 for gross and fine disection        (steps 2.11 – 3.14)
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip for extracellular recording

References

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check_url/cn/52109?article_type=t

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Cite This Article
Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

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