왕새우의 Swimmeret 시스템 : 신경 코드 및 모터 패턴의 세포 외 녹음의 해부를위한 실무 가이드
Summary
Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.
Abstract
여기에서 우리는 왕새우 복부 신경 코드의 해부를 보여줍니다. 제제는 지난 흉부 신경절 (T4, T5) 및 복부 신경절 쇄 (A1 내지 A6)을 포함한다. swimmeret 시스템 : 신경절이 체인 pleopods (swimmerets)의 운동을 구동 코디 중추 신경계 (CNS)의 일부를 포함한다. 그것은 가재의 각 swimmeret이 리듬 교류 활동 1-3를 생성 독자적 패턴 생성 커널에 의해 구동되는 다섯 년 이상으로 알려져있다. 운동 뉴런 swimmeret 각 근육의 해부학 적 및 기능적으로 구별되는 4 개의 집단에 분포를 포함한다. 하나는 swimmeret의 후퇴 (전원 뇌졸중, PS)에 대한 책임이 있습니다. 다른 하나는 swimmeret의 길게 끌기 (귀국일 스트로크, RS)를 구동한다. swimmeret 시스템의 운동 뉴런은 생체 내에서 자연적으로 기록 된 패턴과 동일하다 허구 모터 패턴을 생성 할 수있다 </EM> 1.
이 보고서의 목적은 리듬을 생성하는 네트워크와 학생들의 실제적인 실험 과정에 대한 독립적 인 초소형의 조정을 공부 재미 있고 편리한 모델 시스템을 소개하는 것입니다. 제공하는 프로토콜은 신경의 절연 체인의 달아 신경을 desheathing와 격리 신경 시스템에서 세포 외로 swimmerets 허구 모터 패턴을 기록, 왕새우의 복부 신경 코드의 해부에 대한 단계별 지침이 포함되어 있습니다.
또한, 우리는 수상 돌기에서 세포 내 기록 swimmeret 신경 세포의 활동을 모니터 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 간단히 이러한 기술을 설명하고 몇 가지 예를 제공합니다. 또한, swimmeret 뉴런의 형태는 다양한 염색 기술을 사용하여 평가할 수있다. 여기에서 우리는 염료 가득 뉴런과 swimmeret 운동 신경의 풀 backfills (이온 토 포레 시스에 의해) 세포의 예를 제공합니다. 우리가 실험실에서우리는 세포 수준에서 미세 회로 사이의 허구 운동, 중추 신경계의 활동에 대한 감각 피드백의 효과 및 조정의 기본 기능을 연구하기 위해이 준비를 사용합니다.
Introduction
왕새우 swimmerets는 자세 제어의 기능을 수행하고, 동물이 앞으로 수영 리듬 때 이길 자신의 굴 또는 암컷이 알 5, 6 탄산 가스를 환기 시키십시오. 신호 가재, Pacifastacus의 leniusculus의 swimmerets을, 다섯 번째 두 번째에서 쌍으로 발생 복부 (7)의 각 측면에 하나의 다리와 복부 세그먼트. 중추 신경계 손상은 동물뿐만 아니라 절연 신경 코드 준비 swimmeret 운동 자체를 구동 모터 두둑 리듬에 생성한다. 더 감각 피드백 또는 내림차순 입력되는 현재 존재하지 않는 경우 생성 된 리듬 모터 패턴은 허구 식 이동 (1, 2)라고한다. swimmeret 시스템에서는이 모터 패턴이 그대로 동물에서 측정 swimmerets의 활성에서 어떤 파라미터에서 다르지 않다.
각 swimmeret의 움직임의 위치는 하나의 C로 제한되는 미세 회로에 의해 구동hemiganglion 1 orresponding -. 3 각 저항기에서 다섯 식별 비 요동 치고의 interneurons를 포함하는 패턴 생성 커널이있다. 그들은 기능적 것을 특징으로 할 수 있습니다 동력 행정의 억제제 (IPS) 또는 Return 키 스트로크의 억제제 (IRS) 8. 자신의 교류 활동이 상호 억제 (9)에 의해 구동 오히려 이러한 IPS와 국세청의 interneurons는 내생 발진기 없습니다. 이들의 interneurons 직접 swimmeret 운동 뉴런을 억제하기 때문에, 상기 교류 PS-RS 운동은 열을 발생한다. 운동력은 그러나, 또한 다른 독립 미소의 코디 활성의 생성을 필요로하지 않지만. swimmeret 시스템에서 이러한 조정은 사지가 정확한 시간에 활성화되어 있도록 보장하는 조정 저항기에 의해 설정됩니다. 이 마이크로는 각 세그먼트 11 ~ 15 세 확인 된 신경 세포에 의해 만들어집니다.
이 프로토콜은 일 제공E는 처음 단계별 해부 가이드 신경절 (A6 T4에,도 1)의 체인을 분리. 우리는 고립 된 복부 신경 코드를 고정하고 각 신경절을 desheathe하는 방법을 보여줍니다. 이 격리 신경계 대비, swimmeret 운동을 담당하는 신경 세포 전기 생리 및 형태 학적 실험에 사용하기위한 준비가되어 있습니다. 이 프로토콜의 두번째 부분은 모터 swimmeret 패턴의 주요 특징을 설명한다. 이 세포 외로 레코드에 대한 단계별 가이드를 swimmeret 운동 뉴런의 활동을 포함한다. RS의 운동 신경의 축색 돌기 (axon)은 PS 모터 신경의 축색 돌기 (axon)가 같은 신경의 후방 지점을 통해 (그림 1) 프로젝트 동안, 신경 N1의 전방 지점을 통해 프로젝트 4. 따라서 그들의 활동은 차동 핀 전극이 지점에서 녹음 할 수 있습니다.
<br/> 그림 1 : 복부 신경절 6 (A6)과 T4의 개략도에 흉부 신경절 4 (T4)에서 고립 신경계 :. 흉부 신경절 4; T5 : 흉부 신경절 5; A1, A2 … A6 복부 신경절 1, 복부 신경절이 … 복부 신경절 (6); N1 : 신경 N1; N2 : 신경 N2; N3 : 신경 N3; PS : 파워 스트로크; RS : 리턴 스트로크. 방향 약어 : A = 전방; P = 후방.
이 해부 절차 및 시연 전기 생리학 기술 학부 학생들을위한 편리하고 생리 학생 실용적인 교육 과정을 보완 할 수있다. 신경절 절연 체인 신경계 기능, 조정, 또는 swimmeret 미세 회로 (6)의 변조뿐 아니라 운동 (16) (17) 적응 행동의 신경 조절을 연구하기 위해 다수의 실험에 사용되었다. 가재 swimmeret 시스템은 이와 같이 방대한드립니다 흥미로운 교육 또는 t의모든 가재와 허구 모터 패턴의 세포 외 기록의 복부 신경 코드의 절개로 시작하는 기회를 비가.
Protocol
Representative Results
Discussion
가재의 해부학 및 복부 신경절 이전에 5, 18, 19, 20을 설명되었지만 그것은 중요한 신경의 절단을 방지하기 위해 절개 전에 급 숙지 권장된다.
그것은 고립 된 신경 코드의 저하를 방지하기 위해 23 ° C 이하의 온도에서 준비를 유지하는 것이 중요합니다. 이 용액을 차가운 입욕 가재 염수 매 20-30 분 여분으로 쉽게 달성 될 수있다. 이러한 상황에서 신경절 체인?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그림의 일부 돕는 호세 Burgert 감사합니다. 우리는 잉고 Selbach (및 그룹 "Edelkrebsprojekt NRW") 실험 동물 연구실을 공급하기 위해 자신의 노력에 감사드립니다. 우리는 원고의 첫 번째 버전을 교정 안나 C. 슈나이더 감사합니다. 이 연구는 에미 뇌터 DFG 보조금 SM 206 / 3-1과 여성의 능력에 대한 쾰른 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Type | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | for extracellular recording | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | for intracellular recording | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A | digitizes recorded signals |
| big bucket | filled with ice | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard | for extracellular recording |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 | |
| computer and monitor | equipped with recording software | for extracellular recording | ||
| container and pipette for liquid waste | ||||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | always keep at temperatures ~ 4° C | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 | for intracellular dyefill of neurons |
| differential pin electrodes | made from stainless steel ɸ 0.2 mm | for extracellular recording | ||
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | used in the gross disection | ||
| faraday cage | for extracellular recording | |||
| fixing pins | for pinning the specimen | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 | fine forceps: used to pick nerves |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 | extra fine forceps: used for desheathing |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 | coarse forceps: used to grab specimen and pins |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 | for intracellular recording and dyefill of neurons |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x – 8x | Leica, Germany | 10446298 | for extracellular recording |
| microscope table | for extracellular recording | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | for extracellular recording | ||
| modeling clay | for extracellular recording | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x – 4.5x | Olympus, Germany | for the dissection | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 | used to pin the isolated chain of ganglia |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 | for gross dissection (steps 2.1 – 2.11) |
| saline dispenser with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. | Volume ~ 60ml, | used for exsanguination | ||
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 | for desheathing |
| stainless steel wire ɸ 0.125 mm | to cut pins of 4-7 mm length | Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany | for pinning of the nerve cord | |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 | for gross and fine disection (steps 2.11 – 3.14) |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | ||
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip | for extracellular recording |
References
- Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
- Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
- Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
- Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
- Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
- Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
- Huxley, T. H. . The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).
- Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
- Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
- Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
- Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
- Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
- Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
- Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
- Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
- Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
- Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
- Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
- Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
- Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
- Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
- Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts – Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
- Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).
