क्रेफ़िश के Swimmeret सिस्टम: तंत्रिका कॉर्ड और मोटर पैटर्न की कोशिकी रिकॉर्डिंग का विच्छेदन के लिए एक व्यावहारिक गाइड
Summary
Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.
Abstract
यहाँ हम क्रेफ़िश पेट तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन प्रदर्शित करता है। तैयारी पिछले दो वक्ष गैन्ग्लिया (टी -4, T5) और पेट गैन्ग्लिया की श्रृंखला (ए 6 को A1) शामिल हैं। Swimmeret प्रणाली: गैन्ग्लिया की यह श्रृंखला pleopods (swimmerets) के समन्वित हरकत कि ड्राइव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का हिस्सा भी शामिल है। यह क्रेफ़िश में प्रत्येक swimmeret लयबद्ध बारी गतिविधि 1-3 उत्पन्न करता है कि अपने स्वयं के स्वतंत्र पैटर्न पैदा करने गिरी द्वारा संचालित है कि पांच दशक से अधिक के लिए जाना जाता है। मोटर न्यूरॉन्स प्रत्येक swimmeret की मांसलता anatomically और कार्यात्मक अलग आबादी चार दो समावेश innervating। एक swimmeret का त्याग (बिजली स्ट्रोक, पी एस) के लिए जिम्मेदार है। अन्य swimmeret के अतिकाल (वापसी स्ट्रोक, राज्यसभा) चलाता है। Swimmeret प्रणाली की मोटर न्यूरॉन्स अनायास विवो में दर्ज पैटर्न के समान है, जो एक कल्पित मोटर पैटर्न, उत्पादन करने में सक्षम हैं </उन्हें> 1।
इस रिपोर्ट का उद्देश्य लय पैदा नेटवर्क और छात्रों को 'व्यावहारिक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों के लिए स्वतंत्र microcircuits के समन्वय के अध्ययन के लिए एक दिलचस्प और सुविधाजनक मॉडल प्रणाली लागू है। उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल, गैन्ग्लिया के पृथक श्रृंखला के लगाए गैन्ग्लिया desheathing और पृथक तंत्रिका तंत्र से extracellularly swimmerets कल्पित मोटर पैटर्न रिकॉर्डिंग, क्रेफ़िश के उदर तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन के लिए कदम दर कदम निर्देश शामिल हैं।
इसके अतिरिक्त, हम डेन्ड्राइट से intracellularly दर्ज swimmeret न्यूरॉन्स की गतिविधियों की निगरानी कर सकते। यहाँ हम भी संक्षेप में इन तकनीकों का वर्णन है और कुछ उदाहरण देते हैं। इसके अलावा, swimmeret न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान विभिन्न धुंधला तकनीक का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। यहाँ हम डाई भरा न्यूरॉन्स और swimmeret मोटर न्यूरॉन्स के पूल के backfills (योणोगिनेसिस द्वारा) इंट्रासेल्युलर का उदाहरण देते हैं। हमारी प्रयोगशाला मेंहम एक सेलुलर स्तर पर microcircuits के बीच कल्पित हरकत, सीएनएस की गतिविधि पर संवेदी प्रतिक्रिया का प्रभाव है, और समन्वय के बुनियादी कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस तैयारी का उपयोग करें।
Introduction
क्रेफ़िश के swimmerets मुद्रा नियंत्रण में एक समारोह की सेवा और जानवरों के आगे तैर ताल जब हराया, उनके बिल या मादा अपने अंडे 5, 6 aerate हवादार। संकेत क्रेफ़िश, Pacifastacus leniusculus की swimmerets, पांचवें करने के लिए दूसरे से जोड़े में होते हैं पेट 7 के प्रत्येक पक्ष पर एक अंग के साथ पेट खंड,। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र बरकरार जानवर के रूप में अच्छी तरह से पृथक तंत्रिका कॉर्ड तैयारी में swimmeret आंदोलन चलाता है, जो अपनी ही लयबद्ध मोटर गपशप पर पैदा करता है। कोई संवेदी प्रतिक्रिया या उतरते इनपुट मौजूद है जब उत्पादित लयबद्ध मोटर पैटर्न कल्पित हरकत 1, 2 कहा जाता है। Swimmeret प्रणाली में इस मोटर पैटर्न बरकरार जानवर में मापा swimmerets की गतिविधि से किसी भी पैरामीटर में अलग नहीं है।
प्रत्येक swimmeret के आंदोलन में स्थित है और एक ग के लिए प्रतिबंधित किया गया है एक Microcircuit द्वारा संचालित हैhemiganglion 1 orresponding -। 3 प्रत्येक Microcircuit में पांच की पहचान की गैर spiking interneurons शामिल है कि एक पैटर्न पैदा करने गिरी है। वे कार्यात्मक होने के रूप में लक्षण वर्णन किया जा सकता है या तो पावर स्ट्रोक का अवरोध करनेवाला (आईपीएस) या वापसी स्ट्रोक का अवरोध करनेवाला (आईआरएस) 8। उनकी बारी गतिविधि पारस्परिक निषेध 9 से प्रेरित है बल्कि ये आईपीएस और आईआरएस interneurons, अंतर्जात oscillators के नहीं हैं। इन interneurons सीधे swimmeret मोटर न्यूरॉन्स रोकना है, इसलिए बारी पी एस-आरएस आंदोलन 10 उत्पन्न होता है। हरकत हालांकि, केवल भी अलग स्वतंत्र microcircuits के समन्वय गतिविधि की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, लेकिन यह नहीं है। Swimmeret प्रणाली में इस तरह के समन्वय अंग सही समय पर सक्रिय हैं जो यह सुनिश्चित करता समन्वय Microcircuit द्वारा स्थापित है। इस Microcircuit प्रत्येक खंड 11-15 में तीन की पहचान की न्यूरॉन्स द्वारा बनाया गया है।
इस प्रोटोकॉल वीं के लिए प्रदान करता हैई पहली बार एक कदम-दर-कदम विच्छेदन गाइड गैन्ग्लिया (A6 के लिए टी -4, चित्रा 1) की श्रृंखला को अलग-थलग करने के लिए। हम अलग उदर तंत्रिका कॉर्ड पिन और प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि desheathe करने के लिए कैसे दिखा। इस पृथक तंत्रिका तंत्र तैयार करने में, swimmeret आंदोलन के लिए जिम्मेदार न्यूरॉन्स electrophysiological और रूपात्मक प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग swimmeret मोटर पैटर्न की मुख्य विशेषताओं को दर्शाता है। इस extracellularly रिकॉर्ड करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड swimmeret मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधियों में शामिल हैं। आरएस मोटर न्यूरॉन्स के axons पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स के axons एक ही तंत्रिका के पीछे शाखा के माध्यम से (चित्रा 1) परियोजना है, जबकि तंत्रिका एन 1 के पूर्वकाल शाखा के माध्यम से परियोजना 4। इसलिए उनकी गतिविधि अंतर पिन इलेक्ट्रोड के साथ इन शाखाओं से दर्ज किया जा सकता है।
<br/> चित्रा 1: पेट नाड़ीग्रन्थि 6 (ए 6) और यह टी -4 के एक योजनाबद्ध आरेख को वक्ष नाड़ीग्रन्थि 4 (टी -4) से पृथक तंत्रिका तंत्र:। वक्ष नाड़ीग्रन्थि 4; T5: वक्ष नाड़ीग्रन्थि 5; A1, A2 … ए 6 पेट नाड़ीग्रन्थि 1, पेट नाड़ीग्रन्थि 2 … पेट नाड़ीग्रन्थि 6; एन 1: तंत्रिका एन 1; एन 2: तंत्रिका एन 2; एन 3: तंत्रिका N3 के; पुनश्च: बिजली-स्ट्रोक; आरएस: वापसी स्ट्रोक। दिशात्मक लघुरूप: एक = पूर्वकाल; पी = पीछे।
इस विच्छेदन प्रक्रिया और प्रदर्शन किया electrophysiological तकनीक स्नातक छात्रों के लिए सुविधाजनक हैं और शरीर विज्ञान में छात्र व्यावहारिक पाठ्यक्रम पूरक हो सकता है। गैन्ग्लिया के पृथक श्रृंखला तंत्रिका तंत्र समारोह, समन्वय, या swimmeret microcircuits 6 के मॉडुलन के साथ ही हरकत में 16, 17 में अनुकूली व्यवहार की न्यूरोनल नियंत्रण का अध्ययन करने के प्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है। क्रेफ़िश swimmeret प्रणाली इस प्रकार एक विशाल राशि प्रदान करता है दिलचस्प शिक्षण या टी कीसभी क्रेफ़िश और कल्पित मोटर पद्धति का कोशिकी रिकॉर्डिंग के उदर तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन के साथ शुरू अवसर जो बारिश हो रही है।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्रेफ़िश की शारीरिक रचना और उनके पेट गैन्ग्लिया पहले से 5, 18, 19, 20 में वर्णित किया गया है और यह महत्वपूर्ण नसों के काटने से बचने के लिए विच्छेदन करने से पहले उनके साथ परिचित बनने के लिए सिफारिश की ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आंकड़े से कुछ के साथ मदद करने के लिए जोस Burgert धन्यवाद। हम इंगो Selbach (और समूह "Edelkrebsprojekt NRW") प्रायोगिक पशुओं के साथ प्रयोगशाला की आपूर्ति करने के अपने प्रयासों के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि के पहले संस्करण proofreading के लिए अन्ना सी श्नाइडर धन्यवाद। इस शोध एक एमी नोथेर DFG अनुदान एसएम 206 / 3-1 और महिला संकाय के लिए कोलोन विश्वविद्यालय की एक स्टार्टअप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Type | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | for extracellular recording | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | for intracellular recording | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A | digitizes recorded signals |
| big bucket | filled with ice | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard | for extracellular recording |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 | |
| computer and monitor | equipped with recording software | for extracellular recording | ||
| container and pipette for liquid waste | ||||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | always keep at temperatures ~ 4° C | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 | for intracellular dyefill of neurons |
| differential pin electrodes | made from stainless steel ɸ 0.2 mm | for extracellular recording | ||
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | used in the gross disection | ||
| faraday cage | for extracellular recording | |||
| fixing pins | for pinning the specimen | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 | fine forceps: used to pick nerves |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 | extra fine forceps: used for desheathing |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 | coarse forceps: used to grab specimen and pins |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 | for intracellular recording and dyefill of neurons |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x – 8x | Leica, Germany | 10446298 | for extracellular recording |
| microscope table | for extracellular recording | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | for extracellular recording | ||
| modeling clay | for extracellular recording | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x – 4.5x | Olympus, Germany | for the dissection | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 | used to pin the isolated chain of ganglia |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 | for gross dissection (steps 2.1 – 2.11) |
| saline dispenser with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. | Volume ~ 60ml, | used for exsanguination | ||
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 | for desheathing |
| stainless steel wire ɸ 0.125 mm | to cut pins of 4-7 mm length | Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany | for pinning of the nerve cord | |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 | for gross and fine disection (steps 2.11 – 3.14) |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | ||
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip | for extracellular recording |
References
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